一種利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于雙向電泳技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組(proteome)指“細(xì)胞、組織或機(jī)體內(nèi)的基因在特定生理條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)”，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是對一個機(jī)體的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，包括蛋白質(zhì)的變化、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以從蛋白質(zhì)水平上對生物體的各種生理過程有更全面的認(rèn)識，已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，而雙向電泳(Two-dimens1nal electrophoresis，2-DE)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)之一。以雙向電泳技術(shù)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中，現(xiàn)逐漸延伸到水產(chǎn)科學(xué)及食品科學(xué)方面。
[0003]羅非魚具有生長速度快、繁殖能力強(qiáng)、食性雜、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，且骨刺少、肉質(zhì)厚，是我國主要的淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)品之一。不同品種和不同組織的雙向電泳條件也各不相同，已有關(guān)于大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)肝臟、大菱鮮(Scophthalmusmaximus)表皮、大黃魚(Pseudosciaena crocea)肝臟、斑節(jié)對?!下(Penaeus monodon)血淋巴蛋白質(zhì)雙向電泳體系建立的研究，尚未有關(guān)于羅非魚肌肉蛋白質(zhì)雙向電泳體系建立的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，該方法通過雙向電泳體系能獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖並L曰O
[0005]本發(fā)明上述所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，包括如下步驟:
[0006](I)雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的制備
[0007]選取羅非魚肌肉組織，采用液氮研磨法研磨后，得粉末狀組織，將粉末狀組織用蛋白提取裂解液冰浴超聲提取后，離心，取上清液，將上清液用丙酮沉淀、離心，收集蛋白沉淀，將蛋白沉淀用蛋白提取裂解液溶解后離心，取上清液即得雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)；
[0008](2)檢測雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度
[0009]采用Bradford法檢測步驟(I)中獲得的雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度；
[0010](3)雙向電泳
[0011]等電聚焦電泳:選取24cm、pH值為4?7的等電聚焦膠條，根據(jù)步驟⑵中的可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度，取一定體積的可溶性羅非魚蛋白質(zhì)至其質(zhì)量為135?145yg，配制成上樣液，將上樣液置于等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦電泳；
[0012]膠條平衡:將等電聚焦電泳后的膠條置于平衡液中進(jìn)行平衡；
[0013]十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠電泳:膠條平衡結(jié)束后，將其取出置于電泳緩沖液中浸泡，用含有溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液封膠，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳；
[0014]⑷凝膠染色
[0015]采用硝酸銀染色法對SDS-PAGE凝膠進(jìn)行染色；
[0016](5)圖譜掃描
[0017]用掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜。
[0018]在上述利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法中:
[0019]步驟⑴中所述的蛋白提取裂解液包括以下組分:2.0mol -L 1的硫脲、7.0mol -L 1的尿素、質(zhì)量體積百分含量為4%的CHAPs、65mmol.L 1DTTU^ pH為3?10的B1-Lyte。
[0020]步驟⑵中采用Bradford法檢測步驟(I)中獲得的雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度的具體過程優(yōu)選是:取BSA配制一組具有濃度梯度的BSA溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取步驟(I)中獲取的雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度。
[0021]采用Bradford法檢測時，每個樣品中均加入有Bradford染色液。
[0022]步驟(3)中所述的上樣液包括以下組分:135?145 μ g蛋白質(zhì)、I %二硫蘇糖醇、I %膠條緩沖液和I %溴酚藍(lán)。
[0023]其中，膠條緩沖液的成分包括pH 3?10的B1-Lyte，載體兩性電解質(zhì)，是B1-RAD的一種市售產(chǎn)品，可以增加蛋白質(zhì)的溶解性。
[0024]本發(fā)明上樣液中采用135?145 μ g的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的上樣量是根據(jù)膠條的選擇、染色方法及樣品自身的特性來設(shè)定的，如果上樣量過多會造成圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)堆積，分離效果不好，上樣量過少則會造成某些低豐度蛋白斑點(diǎn)缺失，本發(fā)明中經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，選擇上樣量在135?145 μ g范圍內(nèi)圖譜分辨率高且斑點(diǎn)清晰。
[0025]步驟(3)中等電聚焦電泳時，等電聚焦儀的參數(shù)優(yōu)選為:500V線性升壓60min，1000V 快速升壓 60min，10000V 快速升壓 180min，1000Vh 快速聚焦 250min。
[0026]膠條的長度和pH不同其所需的等點(diǎn)聚焦參數(shù)也不同，窄pH范圍及較長的膠條需要較大的電壓。采用分步升壓的方式達(dá)到最終的聚焦電壓，能夠從膠條中清除樣品中的離子成分，同時減少膠條因電流而產(chǎn)生的熱量。本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，采用上述等電聚焦儀參數(shù)時，圖譜較好。
[0027]步驟(3)中將等電聚焦電泳后的膠條置于平衡液中進(jìn)行平衡時，依次置于平衡液I和平衡液2中，分別平衡12?18min。
[0028]平衡液I包括以下組分:6mol.L 1尿素、2 % SDS、pH值為8.8的50mmol.L 1Tris-HCUO^ 的甘油、I % DTT0
[0029]平衡液2包括以下組分:6mol*L 1 尿素、2% 303、？!1為8.8的50臟01 *L 1Tris-HCl,20%甘油、2.5% IAA (碘乙酰胺)。
[0030]步驟(3)中所述十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠的濃度為12.5%，SDS-PAGE電泳時，電泳起始功率為2W/膠，60min后升至17W/膠，直到溴酚藍(lán)跑到下緣時結(jié)束。
[0031 ] 步驟(4)中采用硝酸銀染色法對SDS-PAGE凝膠進(jìn)行染色的具體過程是:SDS_PAGE電泳后的凝膠用固定液固定120?150min，接著加入敏化液敏化45?75min，并分別用蒸餾水漂洗3?5次，每次8?12min，繼續(xù)用銀染液染色45?75min，并用蒸餾水漂洗2?3次，每次50?70s后以顯色液顯色8?lOmin，最后用終止液終止顯色40?60min，并用蒸饋水漂洗2?3次，每次25?35min。
[0032]所述固定液的組成為:100mL無水乙醇、25mL冰醋酸，以蒸饋水定容至250mL ;所述敏化液的組成為:75mL無水乙醇、17g無水乙酸鈉、0.788g五水硫代硫酸鈉，以蒸饋水定容至250mL ;所述銀染液的組成為:0.625g硝酸銀，以蒸餾水定容至250mL ;所述顯色液的組成為:6.25g碳酸鈉，100 μ L質(zhì)量百分含量為37%的甲醛溶液，以蒸餾水定容至250mL ;所述終止液的組成為:3.65g Na2EDTA.H2O,以蒸餾水定容至250mL。
[0033]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明建立了一種易于操作、適于羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳體系以獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜的方法，該方法為后續(xù)羅非魚肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)，也為其它魚類肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了參考。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中冰溫條件下貯藏Od的用掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜；
[0035]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中冰溫條件下貯藏1d的用掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜；
[0036]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中冰溫條件下貯藏20d的用掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描獲得羅非魚肌肉蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下實(shí)施例中，如無特殊指明，用量或濃度按照本領(lǐng)域教科書中常規(guī)的質(zhì)量百分含量、體積百分含量或質(zhì)量體積百分含量配制的。
[0038]實(shí)施例1貯藏Od的羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜
[0039]本實(shí)施例提供的利用雙向電泳體系獲取羅非魚肌肉蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，包括如下步驟:
[0040](I)羅非魚肌肉蛋白質(zhì)樣品的制備
[0041]將冰溫條件下貯藏Od的羅非魚肌肉洗凈混合剪碎備用，在研缽中倒入液氮預(yù)冷，然后將碎肉組織置于研缽中，迅速加入液氮，待液氮不再沸騰后迅速進(jìn)行研磨，直至組織變成粉末，均勻而無明顯顆粒，得粉末狀組織。
[0042]在粉末狀組織中加入蛋白提取裂解液，置于I %功率冰浴超聲8次后于4°C，12000r.min 1條件下離心20min，收集上清液分裝3管(每管250 μ L)，加入ImL丙酮沉淀12h后于4°C，12000r *min 1條件下離心20min，傾去上清液后低溫自然干燥，得到蛋白質(zhì)團(tuán)塊。
[0043]隨后在蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入500 μ L蛋白提取裂解液，2 %功率超聲助溶后于4°C，12000r.min 1條件下離心20min，取上清液即為雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)。
[0044]其中蛋白提取裂解液包括以下組分:7mol.L 1尿素、2mol.L 1硫脲、4% CHAPS,65mmol.L 1DTTU^ pH 3 ?10 的 B1-Lyte0
[0045](2)蛋白質(zhì)定量
[0046]分別取5、10、15、20、25、30、35 μ g的BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品取4 μ L，雙復(fù)管測定，每支管加入ImL Bradford進(jìn)行染色，漩渦震蕩充分混勻后靜置5min，測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得雙向電泳用可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度。
[0047](3)雙向電泳
[0048]等電聚焦電泳:選用24cm，pH 4?7等電聚焦膠條，根據(jù)可溶性羅非魚蛋白質(zhì)的濃度，取一定體積的可溶性羅非魚蛋白質(zhì)至其質(zhì)量為140 μ g，配制成上樣液，將上樣液置于等電聚焦儀中進(jìn)行等電聚焦電泳，上樣液包括以下組分:140 μ g蛋白質(zhì)、I %二硫蘇糖醇、1%膠條緩沖液、1%溴酚藍(lán)、蛋白提取裂解液補(bǔ)充體積至455 μ L ;等電聚焦電泳程序設(shè)置為:500V線性升壓60min，1000V快速升壓60min，10000V快速升壓180min，10000V快速聚焦 250min。
[0049]膠條的平衡:等電聚焦完成后，取出膠條，用濾紙吸取膠條表面多余液體，依次放入8mL平衡液l、8mL平衡液2中，于搖床上分別平衡15min。
[0050]其中平衡液I包括以下組分:6mol.L 1尿素、2 % SDS、pH值為8.8的50mmol.L 1Tris-HCUO %的甘油、I % DTT ;平衡液2包括以下組分:6mol.L 1尿素、2%SDS、pH 為 8.8 的 50mmol.L 1Tris-HCUO^甘油、2.5% IAA0
[0051]十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):膠條平衡結(jié)束后，將其取出置于電泳緩沖液中浸泡5s，將膠條正極與電泳儀正極方向一致，膠條下端緊密接觸二向膠面，用含有溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液封膠，采用濃度為12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳起始功率為2W/膠，60min后升至17W/膠，直到溴酚藍(lán)跑到下緣時結(jié)束(約270min)。
[0052]其中電泳緩沖液的組成為:10倍的電泳緩沖液成分I % SDS、250mM T