檢測葉酸靶蛋白用檢測體系及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測葉酸靶蛋白用檢測體系及其檢測方法，特別是一種基于磁性石墨烯對樣本富集分離和以雙鏈DNA為模板合成銅納米顆粒實現(xiàn)信號放大相結(jié)合的檢測靶蛋白用檢測體系及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質(zhì)一直是生命科學研究的重點，研究蛋白質(zhì)的生理功能對促進生命科學的發(fā)展具有重要意義。生物傳感由于其操作簡便快速且儀器成本相對較低的優(yōu)勢，成為了蛋白質(zhì)研究中具有重要地位的分析技術之一。雖然特定的代表蛋白可以通過抗體、適體甚至小分子作為識別元件來實現(xiàn)檢測，但其檢測的靈敏度有可能受到不利影響，限制了傳感器的實際應用。例如，樣本或者檢測緩沖中存在潛在的干擾物質(zhì)會增加檢測的背景信號，單標記探針產(chǎn)生的檢測信號較弱等，都可大大降低蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。因此，開發(fā)靶分子富集技術和信號放大技術對提高傳感器的靈敏度有重要意義。
[0003]納米材料因其具有獨特的電學、光學、機械性和磁性性能已被廣泛使用。近年來，以石墨烯為平臺建立的生物傳感器在生物學研究中引起關注，尤其是磁性石墨烯的應用。磁性石墨烯是Fe3O4磁性納米粒子和石墨烯的復合物，具有良好的水溶性、電子傳遞性以及機械性能和熱力學性能，且可以呈現(xiàn)出磁性納米Fe3O4的磁性分離性能和石墨烯吸附富集的優(yōu)勢。此外，因為單鏈DNA(ssDNA)可以借助其表面堿基通過疏水作用和π - π作用吸附在石墨烯的表面，所以擁有大尺寸二維芳香平面的石墨烯可以作為修飾特定生物分子的基底對樣本富集分離。另一方面，銅納米顆粒也是近年廣被關注與研究的納米材料，Cu2+被抗壞血酸還原后形成Cu原子，Cu原子在雙鏈DNA模版上團聚而形成銅納米顆粒。在酸性條件下合成的銅納米顆粒又被還原成銅離子游離到溶液中，并通過溶解氧進一步催化鄰苯二胺(OPD)的氧化以產(chǎn)生電活性2，3- 二氨基吩嗪(DAP)。
[0004]目前，葉酸結(jié)合蛋白的檢測技術主要有質(zhì)譜、親和層析、動力學毛細管電泳、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和酶互補片段免疫分析等。但是這些檢測技術有的需要昂貴的儀器，操作復雜，有的耗時費力，靈敏度低，均難以滿足日常快速分析的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于銅納米顆粒和磁性氧化石墨烯的檢測葉酸靶蛋白用檢測體系及其檢測方法。
[0006]本發(fā)明是采用電化學技術對蛋白質(zhì)的特異性和靈敏性的檢測。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的機理如下:當葉酸結(jié)合蛋白不存在時，與葉酸標記的Probe鏈雜交的cDNA會被Exo III酶從3’末端開始逐步水解成單核苷酸，而在無雙鏈DNA模板的情況下銅納米顆粒不能合成，因而不能引起電化學響應。當葉酸結(jié)合蛋白存在時，葉酸標記的Probe鏈通過葉酸和葉酸受體的特異性作用連接上葉酸結(jié)合蛋白產(chǎn)生明顯的位阻效應，從而保護cDNA鏈不被Exo III水解。此時，以雙鏈DNA為模板可以合成銅納米顆粒。銅納米顆粒覆蓋的核酸鏈可以通過Probe鏈的3’突出末端與磁性石墨烯結(jié)合，并在磁場作用下與反應溶液分離。之后，石墨烯表面的銅納米顆粒被硝酸氧化為銅離子。經(jīng)過磁場分離石墨烯固體后，溶液中的銅離子催化鄰苯二胺(OPD)氧化為電活性的2，3_ 二氨基吩嗪(DAP)，產(chǎn)生顯著的電化學信號放大效果。因此，通過電化學信號的靈敏變化就能夠檢測到很低濃度的葉酸受體，參見圖1。
[0007]根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種檢測葉酸靶蛋白用檢測體系，其特征在于每100 yL該傳感體系含有70 uLMops-Buffer、25 μ L 4XExo III BufTer、l uL 10 uM 的 Probe 鏈和 I uL 10 uM 該鏈的互補cDNA鏈，在90 °C?95 °C的恒溫下加熱5?10 min，冷卻至室溫；所述的Probe鏈為:5’-folate-NH-GCGTCACATGGCTAGGGTAAAGTCTACGGCCGGGTAGA-3’ ；
所述的互補 cDNA 鏈為:5’ -CTAGCCATGTG ACGC -3’。
[0008]上述的檢測葉酸革E蛋白用檢測體系，其特征在于所述的Mops-Buffer為:20 mMMOPS、30 mM NaCl，pH 7.5。
[0009]上述的檢測葉酸革E蛋白用檢測體系，其特征在于所述的4XExo III Buffer為:20 mM Tris-HCU 3 mM MgCl2、50 mM NaCl，pH 7.4。
[0010]一種葉酸靶蛋白的檢測方法，采用上述的檢測葉酸靶蛋白用檢測體系，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.在每100μ L上述檢測體系中，加入I μ L待測溶液，于37 °C溫度下恒溫1.5 h，然后，加入 0.1 unit/μ L Exo III 在 37°C下酶切 30 min，升至 80 °C滅活 10 min ;
b.在每100μ L步驟a所得溶液中加入I μ L、100 mM的抗壞血酸，震動混勻后加入50 μ L、200 μ M的無水硫酸銅到混合液，室溫反應15 min,以在雙鏈DNA表面形成銅納米顆粒；
c.取磁性氧化石墨烯的二甲基亞砜溶液加入到步驟c所得溶液體系中，使該溶液體系中氧化石墨稀的濃度為100 μ g/mL，震搖20 min,使步驟b所得雙鏈DNA吸附在磁性氧化石墨烯上，之后將該吸附有雙鏈DNA的磁性氧化石墨烯與反應溶液分離；
d.將步驟c所得磁性氧化石墨烯浸沒在0.5 M的硝酸中，然后將該磁性氧化石墨烯從溶液中分離；
e.在步驟d所得溶液與濃度為Img/mL的鄰苯二胺OPD溶液按1:1.5?2的體積比混合，80 °C恒溫反應10 min，然后利用電化學工作站并用差分脈沖伏安法測定分析電活性物質(zhì)的信號變化，實現(xiàn)了葉酸受體在溶液中的檢測。
[0011]本發(fā)明利用磁性氧化石墨烯對樣本的富集分離特性，借助以DNA雙鏈為模板合成銅納米顆粒產(chǎn)生的信號放大的高度靈敏性，實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的靈敏檢測。本發(fā)明以葉酸作為代表研究了其與葉酸受體蛋白之間的相互作用，理論上可以推廣對其他類型的小分子與靶蛋白相互作用進行檢測。由于葉酸受體蛋白本身是一種腫瘤標志物，該方法還可以用于腫瘤標志物的檢測，對腫瘤的臨床監(jiān)測提供技術支持，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明的方法原理圖。
[0013]圖2為在雙鏈DNA無酶切、單鏈DNA無酶切、雙鏈DNA加酶切、葉酸結(jié)合蛋白存在條件下雙鏈加酶切等四種情況下電化學信號的脈沖差分伏安圖。
[0014]圖3為不同濃度的葉酸受體蛋白存在情況下得到的電化學信號變化圖。
[0015]圖4為葉酸受體蛋白濃度和電化學信號峰值之間的關系圖。其中內(nèi)嵌圖為蛋白質(zhì)濃度在0.01 ng/mL到100 ng/mL范圍內(nèi)與電化學信號變化值之間的線性關系圖。
[0016]圖5為不同種類的蛋白存在條件下獲得的電化學信號變化圖。
[0017]圖6為血清檢測濃度與實際濃度對照的統(tǒng)計表。
【具體實施方式】
[0018]實施例一:雙鏈DNA為模板合成銅納米顆粒流程
a.配制 100 μ L 的反應體系，其中加入 Mops-Buffer 70 yL、4XExo III Buffer 25μ L、10 uM的Probe鏈I μ L和10 uM的cDNA鏈I μ L混成均勻的溶液，放置于90 °C的恒溫金屬浴加熱10 min后，自然冷卻至室溫，DNA雙鏈發(fā)生雜交反應I h。在Probe鏈和cDNA鏈已發(fā)生雜交反應的溶液中，取10 μ L葉酸結(jié)合蛋白加入到反應液中，使之終濃度分別為 0、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、I ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL 和 500 ng/mL，置于 37 °0|?溫金屬浴中 1.5 h，葉酸結(jié)合蛋白將識別并結(jié)合修飾在Probe鏈上5’端的葉酸分子。然后，加入I μ L ExoIII在37°C下酶切30 min，升至80 °C滅活10 min。