通過成像質(zhì)譜裝置得到的具有特定質(zhì)荷比的物質(zhì)的二維分布的質(zhì)譜成像圖像比較圖。噴涂法的情況下，m/z769.56下只能得到非常不清晰的圖像，m/z760.58下變?yōu)闊o法反映樣品上組織邊界的圖像。即，噴涂法下檢測到的峰值數(shù)雖然較多，但質(zhì)譜成像圖像非常不清晰，不適于成像質(zhì)譜分析。與此相對，蒸鍍法以及蒸鍍+噴涂法中，可以得到比噴涂法清晰得多的圖像。
[0060]圖10是m/z848.400?848.800的較窄質(zhì)荷比范圍的質(zhì)譜。要注意，圖10(a)的縱軸(信號強度軸)的刻度是圖10(b)的10倍。例如觀察m/z848.648的峰值強度，蒸鍍+噴涂法是蒸鍍法的約4倍。S卩，蒸鍍+噴涂法顯示出比蒸鍍法高的靈敏度。圖11是該質(zhì)荷比范圍附近的質(zhì)譜成像圖像。如上所述，由于蒸鍍+噴涂法的信號檢測靈敏度高于蒸鍍法，因此質(zhì)譜成像圖像上該物質(zhì)存在的像素強度值大，從其結(jié)果可以確認(rèn)，可以清晰顯示出該物質(zhì)所存在的部位。
[0061]從以上結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的一個方法之蒸鍍+噴涂法特別適合成像質(zhì)譜分析，較之于單純的蒸鍍法，優(yōu)點是檢測到的峰值數(shù)多(即可以得到更多的成分信息)，可以得到清晰的質(zhì)譜成像圖像，特別是由于靈敏度高，量少成分也可以得到清晰的質(zhì)譜成像圖像。
[0062][第2實驗的方法以及結(jié)果]
該第2實驗中，作為測定對象的樣品，使用了正常的老鼠肝臟的10[μπι]切片。此外，該實驗中，基質(zhì)物質(zhì)為CHCA，使用的分析裝置為島津制作所制造的成像質(zhì)譜裝置，MALDI離子源的照射激光直徑為20 [ μ m]，樣品上的激光光斑的間距為25 [ μ m]，分析范圍內(nèi)的分析點數(shù)為70 X 52，質(zhì)荷比范圍為m/z 100?670。此外，對于置于導(dǎo)電性樣品玻璃上的樣品表面的基質(zhì)物質(zhì)蒸鍍，使用島津制作所株式會社制造的蒸鍍裝置，蒸鍍條件為氣壓:10[Pa]，蒸鍍源溫度:240°C，蒸鍍時間:約4分鐘。此時的氣壓，作為一般的蒸鍍條件是非常低的真空度。另外，蒸鍍時間實際上并非以時間來決定蒸鍍停止的時點，而是以蒸鍍膜層表面出現(xiàn)2條干涉條紋的時點停止蒸鍍。其結(jié)果是，蒸鍍時間為約4分鐘?；|(zhì)膜層的厚度為約0.6 [ μ m] ο
[0063]試樣調(diào)制方法，除了第I實驗中的“蒸鍍法”，還嘗試了以下4種方法。
(I)蒸鍍基質(zhì)物質(zhì)后，用噴槍只噴射噴霧溶劑(75%乙醇，25%水)(以下稱為“蒸鍍+溶劑噴涂法”)。 (2)蒸鍍基質(zhì)物質(zhì)后，用噴槍噴射噴霧低濃度基質(zhì)溶液(上述溶劑中溶解10[mg/mL]濃度的CHCA)(以下稱為“蒸鍍+低濃度溶液噴涂法”)。
(3)蒸鍍基質(zhì)物質(zhì)后，用霧化器只噴霧溶劑(75%乙醇，25%水)(以下稱為“蒸鍍+溶劑霧化器法”)。
(4)蒸鍍基質(zhì)物質(zhì)后，用霧化器噴霧與(2)同樣的低濃度基質(zhì)溶液(以下稱為“蒸鍍+低濃度溶液霧化器法”)。
但是(3)、(4)中，霧化器噴霧重復(fù)進行10秒XlO次(間隔10秒以上)，以此實施間歇性的噴霧。如此使用霧化器的話，較之于噴槍噴霧，噴霧出的溶液液滴變得非常微細。
[0064]圖12是顯示實施了蒸鍍法的情況下，涂布基質(zhì)后的樣品表面的顯微觀察圖像(a)、分析范圍內(nèi)的所有分析點得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜(b)、以及代表性的質(zhì)譜成像圖像(C)的圖。
圖13是顯示實施了蒸鍍+溶劑噴涂法的情況下，涂布基質(zhì)后的樣品表面的顯微觀察圖像(a)、分析范圍內(nèi)的所有分析點得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜(b)、以及代表性的質(zhì)譜成像圖像(C)的圖。
圖14是實施了蒸鍍+低濃度溶液噴涂法的情況下，涂布基質(zhì)后的樣品表面的顯微觀察圖像(a)、分析范圍內(nèi)的所有分析點得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜(b)、以及代表性的質(zhì)譜成像圖像(C)的圖。
[0065]圖15是顯示實施了蒸鍍+溶劑霧化器法的情況下，涂布基質(zhì)后的樣品表面的顯微觀察圖像(a)、分析范圍內(nèi)的所有分析點得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜(b)、以及代表性的質(zhì)譜成像圖像(C)的圖。
圖16是顯示實施了蒸鍍+低濃度溶液霧化器法的情況下，涂布基質(zhì)后的樣品表面的顯微觀察圖像(a)、分析范圍內(nèi)的所有分析點得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜(b)、以及代表性的質(zhì)譜成像圖像(C)的圖。
圖12?圖16中，(b)都是所有分析點(70X52點)中得到的質(zhì)譜的平均質(zhì)譜。此外，圖12?圖15中，(c)都是亞精胺(Spermidine)、精胺(Spermine)以及基質(zhì)之CHCA(Adduct1n)等三個物質(zhì)的質(zhì)譜成像圖像。
[0066]從這些圖可知，在不進行溶劑或低濃度溶液噴霧的蒸鍍法中，整體的檢測靈敏度非常低，在質(zhì)譜成像圖像上，也幾乎無法觀測到通常推測分布在整個樣品內(nèi)的亞精胺、精胺。與此相對，特別是低濃度溶液噴射或使用霧化器噴霧的話，整體的檢測靈敏度提升，檢測到的峰值數(shù)也增加。此外可以確認(rèn)，質(zhì)譜成像圖像上，相當(dāng)于亞精胺、精胺的像素強度值變大，因此可以清晰顯示出這些物質(zhì)的存在部位。另外，使用了霧化器的溶劑噴霧中，檢測靈敏度提升到了與低濃度溶液噴霧相同的程度，但使用了噴射的溶劑噴霧中，無法確認(rèn)檢測靈敏度的提升?？梢酝茰y，這不是因為噴槍和霧化器的噴霧方法的差異，而是噴霧出的液滴大小的影響較大。
[0067]圖17是圖12(b)?圖16(b)所示質(zhì)譜中顯示出的亞精胺、精胺以及CHCA對應(yīng)峰值的峰值面積、對于來自基質(zhì)的峰值的強度比、與僅蒸鍍情況下的強度比的實驗結(jié)果匯總圖。觀察圖17(b)可以確認(rèn)，無論是溶劑噴霧還是低濃度溶液噴霧，通過使用霧化器進行噴霧，亞精胺、精胺的峰值強度比增大。這些物質(zhì)是水溶性的聚胺類，對于這些水溶性的物質(zhì)，可以得出結(jié)論，即使不噴霧基質(zhì)溶液，只要噴霧與水混合的有機溶劑，就可以得到充分大的檢測靈敏度改善效果。
此外，如上所述，即使噴射噴霧低濃度溶液，也可以提升聚胺類等物質(zhì)的檢測靈敏度，觀察圖17(c)很明顯，來自基質(zhì)的峰值強度的增大也很顯著。因此，無論使用溶劑還是低濃度溶液，較為理想的不是大液滴，而是進行微細液滴的噴霧。
[0068]此外，第I實驗中，在充分高的真空度(10 3[Pa]程度的氣壓)下進行蒸鍍，與此相對，在該第2實驗中，基質(zhì)物質(zhì)蒸鍍時的真空度非常低。由此可知，只要適當(dāng)控制基質(zhì)膜層厚度的話，即使在低真空條件下實施基質(zhì)物質(zhì)蒸鍍，也可以得到良好的分析結(jié)果。
[0069]另外，上述實施例均只是本發(fā)明的一例，在本發(fā)明主旨范圍內(nèi)的適當(dāng)變形、追加、修正也包含于本申請的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種MALDI用試樣調(diào)制方法，其是調(diào)制用于使用了基質(zhì)輔助激光解吸離子化法的質(zhì)譜分析的試樣的試樣調(diào)制方法，其特征在于，實施如下步驟: a)基質(zhì)層疊步驟，在真空氣氛中使基質(zhì)物質(zhì)氣化，使該基質(zhì)物質(zhì)層疊在載有作為測定對象的樣品的試樣基板表面； b)溶劑導(dǎo)入步驟，使形成在所述試樣基板上的基質(zhì)膜層表面與氣體狀或液體狀的規(guī)定溶劑接觸，使該溶劑浸潤到所述基質(zhì)膜層中； c)基質(zhì)再層疊步驟，在真空氣氛中使基質(zhì)物質(zhì)氣化，再次使基質(zhì)物質(zhì)層疊在所述溶劑已浸潤的狀態(tài)的、或浸潤溶劑已揮發(fā)的狀態(tài)的所述基質(zhì)膜層表面。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MALDI用試樣調(diào)制方法，其特征在于， 所述溶劑導(dǎo)入步驟中，在充滿了氣化溶劑的容器內(nèi)，將形成有基質(zhì)膜層的試樣基板放置規(guī)定時間，由此使該溶劑浸潤到基質(zhì)膜層中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MALDI用試樣調(diào)制方法，其特征在于， 所述溶劑導(dǎo)入步驟中，向形成在試樣基板上的基質(zhì)膜層表面噴霧溶劑，由此使該溶劑浸潤到基質(zhì)膜層中。4.一種MALDI用試樣調(diào)制裝置，是用于權(quán)利要求2所述的MALDI用試樣調(diào)制方法的試樣調(diào)制裝置，其特征在于，具備有: a)可密閉的容器； b)將該容器內(nèi)維持真空氣氛的真空排氣部； c)將載有作為測定對象的樣品的試樣基板保持在所述容器內(nèi)的試樣保持部； d)與該試樣保持部所保持的試樣基板的樣品放置面相對配置，在所述容器內(nèi)將基質(zhì)物質(zhì)加熱并蒸鍍在所述試樣基板上的蒸鍍源； e)在所述真空排氣部沒有進行真空排氣的狀態(tài)下，向所述容器內(nèi)導(dǎo)入氣化溶劑的氣化溶劑供給部， 所述MALDI用試樣調(diào)制裝置能夠在所述容器內(nèi)通過所述試樣保持部保持住試樣基板的狀態(tài)下，依次實施所述基質(zhì)層疊步驟、所述溶劑導(dǎo)入步驟以及所述基質(zhì)再層疊步驟。5.一種MALDI用試樣調(diào)制方法，是調(diào)制用于使用了基質(zhì)輔助激光解吸離子化法的質(zhì)譜分析的試樣的試樣調(diào)制方法，其特征在于，實施如下步驟: a)基質(zhì)層疊步驟，在真空氣氛中使基質(zhì)物質(zhì)氣化，使該基質(zhì)物質(zhì)層疊在載有作為測定對象的樣品的試樣基板表面； b)溶液導(dǎo)入步驟，向形成在所述試樣基板上的基質(zhì)膜層表面，噴霧濃度比基質(zhì)涂布法所使用的基質(zhì)溶液低的基質(zhì)溶液，使該溶液浸潤到基質(zhì)膜層中。
【專利摘要】在導(dǎo)電性載玻片上粘貼生物組織切片等樣品(S1)后，通過真空蒸鍍，形成覆蓋樣品的適當(dāng)?shù)幕|(zhì)(Matrix)物質(zhì)膜層(S2)。該膜層中的基質(zhì)物質(zhì)的結(jié)晶非常細，均勻性也高。接著，將形成有基質(zhì)膜層的載玻片置于氣化溶劑氣氛中，使溶劑浸潤到基質(zhì)膜層中(S3)。充分浸潤的溶劑氣化時，樣品中的測定對象物質(zhì)進入基質(zhì)中而再結(jié)晶化。另外，通過真空蒸鍍，在其表面再次形成基質(zhì)膜層(S4)。追加的基質(zhì)膜層會在MALDI時吸收激光的過剩能量，抑制測定對象物質(zhì)的改性等，因此在具有高空間分辨率的同時可以實現(xiàn)高檢測靈敏度。
【IPC分類】G01N27/64
【公開號】CN105209899
【申請?zhí)枴緾N201480019830
【發(fā)明人】緒方是嗣, 高橋和輝, 久保亞紀(jì)子, 末松誠, 山本卓志
【申請人】株式會社島津制作所, 學(xué)校法人慶應(yīng)義塾
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年4月4日
【公告號】EP2975393A1, EP2975393A4, US20160035553, WO2014162557A1, WO2014163179A1