模塊410及檢測模塊420。
[0068]測量模塊410從串聯(lián)質(zhì)譜儀接收多個產(chǎn)物離子譜的一或多個所測量產(chǎn)物離子譜。 串聯(lián)質(zhì)譜儀通過以下步驟對蛋白質(zhì)生物治療產(chǎn)品樣本執(zhí)行循序窗口化采集：使前驅(qū)體質(zhì)量 窗口跨質(zhì)量范圍循序步進(jìn)，使每一步進(jìn)式如驅(qū)體質(zhì)量窗口的經(jīng)傳輸如驅(qū)體尚子破碎，以及 分析從破碎的經(jīng)傳輸前驅(qū)體離子產(chǎn)生的產(chǎn)物離子。在數(shù)據(jù)采集之前無任何有關(guān)污染蛋白質(zhì) 的信息的情況下執(zhí)行循序窗口化采集。循序窗口化采集針對質(zhì)量范圍產(chǎn)生多個產(chǎn)物離子 譜。
[0069] 檢測模塊420將一或多個所測量產(chǎn)物離子譜與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)庫進(jìn)行比較，并且 通過報告來自庫的匹配一或多個所測量產(chǎn)物離子譜的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)來檢測一或多個宿 主細(xì)胞污染物
[0070] 數(shù)據(jù)實(shí)例
[0071] 圖5圖解說明根據(jù)各種實(shí)施例的用于來自復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣本的蛋白質(zhì)特性化的 例示性 TripleTOF? 5600 系統(tǒng) 500。
[0072] 樣本制備
[0073] 在各種實(shí)施例中，IgGl mAb經(jīng)還原或烷基化及胰蛋白酶消化。此消化產(chǎn)物的恒定 濃度摻加有表示污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的變化性含量的0半乳糖苷酶消化濃度的范圍。
[0074] 色譜法
[0075] 在各種實(shí)施例中，使用Eksigent ekspert?ultraLC 100-XL系統(tǒng)分析樣本。將變 化量的裂解液加載到（例如）〇. 5或1. OmmX 10cm ChromXP C18-CL 3im120A管柱上。運(yùn) 行120或240分鐘內(nèi)（例如）3%到35%乙腈（0? 1 %甲酸）的洗脫梯度。
[0076] 質(zhì)譜法
[0077] 在各種實(shí)施例中，使用（例如）TripleTQF# 5600系統(tǒng)分析未經(jīng)改性且經(jīng)摻加mAb 消化產(chǎn)物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解同樣可使用其它類型的質(zhì)譜系統(tǒng)。
[0078] 在各種實(shí)施例中，舉例來說，使用信息相依性采集（IDA)液相色譜法MS/MS (LCMS/ MS)方法執(zhí)行肽鑒定。本文中僅出于圖解說明目的描述IDA LCMS/MS。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人 員將了解同樣可使用其它類型的質(zhì)譜方法。
[0079] 在各種實(shí)施例中，一式三份地對每一樣本執(zhí)行例如SWATH?采集的數(shù)據(jù)獨(dú)立性采 集策略以使用（例如）10或25Da Q1窗口寬度采集介于400m/z與1200m/z之間的每個前 驅(qū)體的定量MS/MS色譜圖。本文中僅出于圖解說明目的描述SWATH?采集。所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員將了解同樣可使用其它類型的數(shù)據(jù)獨(dú)立性采集技術(shù)。
[0080] 在各種實(shí)施例中，分析所提取離子色譜圖的峰區(qū)以提供來自經(jīng)消化mAb的每一肽 的化學(xué)狀態(tài)的定量指紋。TripIcTOFR 5600系統(tǒng)的高靈敏度實(shí)現(xiàn)非?？焖俚腗S/MS采集速 率，從而允許（例如）MS/MS以IDA模式的低至20毫秒（ms)的累計(jì)時間。
[0081] 在各種實(shí)施例中，為充分利用儀器速度并獲得最佳覆蓋深度，可最佳化IDA工作 流程，使得軟件開銷最小化。在各種實(shí)施例中，IDA方法包含高分辨率飛行時間（TOF)MS調(diào) 查掃描，接著立刻繼以（例如）20MS/MS掃描（具有50毫秒最小累計(jì)時間）。所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員將了解同樣可應(yīng)用不同數(shù)目個MS/MS掃描。
[0082] 在各種實(shí)施例中，使用（例如）Nanospray5>in源及經(jīng)加熱界面噴射來自管柱的 洗脫液。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解同樣可使用其它噴射方法。
[0083] 數(shù)據(jù)處理
[0084] 在各種實(shí)施例中，使用（例如）具有集成錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR)分析的ProtdnPiiol，? 軟件4. 5處理所有數(shù)據(jù)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解同樣可使用其它類型的數(shù)據(jù)處理軟件 工具。
[0085] 在各種實(shí)施例中，使用（例如）在PeakVicw3丨:軟件以及MarkerView?統(tǒng)計(jì)分析軟 件內(nèi)部具有SWATH?采集MicroApp的附帶MS/MS Aa執(zhí)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。本文中僅出于圖 解說明目的描述這些軟件工具。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解同樣可使用其它類型的數(shù)據(jù)處 理軟件工具。
[0086]具有 SWATH?采集的 MS/MS ALL
[0087] 在各種實(shí)施例中，舉例來說，用于使用循序窗口化采集串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蛋白質(zhì)生 物治療產(chǎn)品中的宿主細(xì)胞污染物的方法及系統(tǒng)利用具有SWATH?采集的MS/MSAa。
[0088] 在各種實(shí)施例中，具有SWATH?采集的MS/MSAa是在單個運(yùn)行中由（例如）采集復(fù) 雜樣本中的所有可檢測分析物的高分辨率可量化MS/MS數(shù)據(jù)的TripleTOF?系統(tǒng)技術(shù)實(shí) 現(xiàn)的數(shù)據(jù)獨(dú)立性工作流程。本文中僅出于圖解說明目的描述TripleTO「<系統(tǒng)。所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員將了解同樣可使用其它類型的采集系統(tǒng)。
[0089] 在各種實(shí)施例中，SWATH?采集使用跨質(zhì)量范圍步進(jìn)的寬隔離窗口，從而以色譜時 間標(biāo)度收集高分辨率復(fù)合MS/MS光譜。
[0090] 在各種實(shí)施例中，具有SWATH?采集的MS/MS Aa通過在高分辨率下產(chǎn)生采集后碎片 離子提取離子色譜圖（XIC)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)處理以用于定量與身份確認(rèn)。
[0091] 在各種實(shí)施例中，具有SWATH?采集的MS/MSAa實(shí)現(xiàn)樣本中所有事物的定量及確 認(rèn)，提供對樣本中所有事物的數(shù)字記錄，且提供用于采集所有數(shù)據(jù)的單個方法。
[0092] SWATH?利用高分辨率MS2以用于高保真定量
[0093] 圖6是根據(jù)各種實(shí)施例的例示性SWATH?掃描模態(tài)概述600。標(biāo)準(zhǔn)多反應(yīng)檢測 (MRM)定量610具有兩個四極子上的0. 7Da隔離，從而產(chǎn)生展示為假產(chǎn)物離子表示615的 單反應(yīng)檢測（SRM)跟蹤。在Tripk'TOFK 5600系統(tǒng)上可得的高分辨率MRM或MRMhr620仍 在0. 7Da的寬度下掃描Q1，但碎片離子色譜圖可從窄得多的寬度（0.007Da)下的高分辨率 (>30K)MS/MS掃描提取，從而實(shí)現(xiàn)較高靈敏度。MRMhr 620產(chǎn)生高分辨率且高質(zhì)量準(zhǔn)確度產(chǎn) 物離子譜625。SWATH?技術(shù)630最大化MS/MS分辨率的使用，從而從Q1寬隔離（約25Da) 的破碎提取窄碎片離子色譜圖。SWATH?技術(shù)630產(chǎn)生高分辨率及高質(zhì)量準(zhǔn)確度產(chǎn)物離子 譜 635。
[0094] 綜合定量
[0095] 圖7圖解說明根據(jù)各種實(shí)施例的獲得有關(guān)所有離子的MS/MS數(shù)據(jù)并可提供綜合定 量的例示性SWATH?掃描700。通過使質(zhì)量范圍以25Da增量步進(jìn)，觀察所有所觀察離子的碎 片離子色譜圖。使用寬四極子1(Q1)隔離窗口（例如，25Da或用戶定義的）。TripleTOFK 5600系統(tǒng)速度允許對質(zhì)量范圍的完全覆蓋。獲得所有碎片離子的高分辨率XIC數(shù)據(jù)。 [0096] 結(jié)果/總結(jié)
[0097] 在試驗(yàn)中，在數(shù)據(jù)獨(dú)立性工作流程中，使Q1四極子跨目標(biāo)質(zhì)量范圍以25Da步階的 增量步進(jìn)。在碰撞室中使來自25Da寬窗口的經(jīng)傳輸離子破碎，并在高分辨率下的TOF MS 分析儀中分析碎片。此在LC循環(huán)時間內(nèi)完成，使得采集樣本中的每個肽上的MS/MS光譜。 然后在采集后產(chǎn)生高分辨率XIC以用于量化。扼要描述此mAb的異質(zhì)性，觀察95. 8%的肽 序列涵蓋率。觀察四個脫酰胺作用位點(diǎn)及五個氧化作用位點(diǎn)，且將其肽相對于未經(jīng)改性形 式而量化。依據(jù)重復(fù)分析的峰區(qū)的比較通常在5%循環(huán)伏安法（CV)內(nèi)。另外，數(shù)據(jù)指示可 檢測遠(yuǎn)低于0. 01 %污染物含量下的〃宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)〃。使用定量SWATH?方法，在單個樣 本運(yùn)行中，可采集有關(guān)來自介于400m/z與1200m/z之間的每個前驅(qū)體肽離子的每個碎片離 子的MS/MS數(shù)據(jù)。通過回顧性地檢查數(shù)據(jù)，可以如MRM -樣的保真度及靈敏度對PTM異質(zhì) 性及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)污染的程度進(jìn)行量化，而無需任何預(yù)先方法建立或?qū)TM或污染蛋白 質(zhì)的預(yù)知。
[0098]目標(biāo)采集策略的接入特異性
[0099] 圖8是展示根據(jù)各種實(shí)施例的具有5個或5個以上無干擾轉(zhuǎn)換的可觀察肽百分比 如何隨前驅(qū)體及碎片離子隔離的窗口寬度而變化的例示性繪圖800。黑色區(qū)610繪示具有 少于4個無干擾轉(zhuǎn)換的肽百分比，且白色區(qū)620繪示具有5個或5個以上無干擾轉(zhuǎn)換的肽 百分比。SWATH?是在選擇性方面堪比MRM的唯一 DIA技術(shù)。
[0100] 參考圖8,量化的目標(biāo)是具有每肽的多個碎片離子以用于XIC產(chǎn)生及集成。在各種 實(shí)施例中，使用來自肽儲存庫（例如，Peptide Atlas)的肽，計(jì)算依據(jù)隔離及檢測分辨率所 觀察的碎片離子干擾的頻率。隨著隔離或檢測上的分辨率減少，具有五個無干擾XIC的肽 的數(shù)目下降。
[0101] 單個SWATH?采集窗口
[0102] 圖9是展示根據(jù)各種實(shí)施例的SWATH?數(shù)據(jù)的實(shí)例的例示性繪圖集合900。具 體來說，圖9展示單個SWATH?數(shù)據(jù)集的可視化繪示。色譜圖910及熱圖920是依據(jù) 550-575SWATH?的m/z比率。在此單個采集內(nèi)部，存在正如上文的23個其它三位數(shù)據(jù)集。 在圖9中展示的熱圖920中，X軸表示時間，Y軸為m/z比率，且強(qiáng)度由顏色表示。水平框指 示q 1選擇窗口，且所述框外部的所有離子都為碎片。舉例來說，每一垂直條紋為垂直框內(nèi) 部的MS/MS光譜。
[0103] 參考圖9,在各種實(shí)施例中，方法及系統(tǒng)使用25Da窗口覆蓋LC時間幀中的肽質(zhì)量 范圍。圖9也展示三維數(shù)據(jù)，以及介于550到575質(zhì)量對電荷（m/z)