臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種過氧化物酶的測(cè)定試劑盒，特別是涉及一種用于定量檢測(cè)髓過氧 化物酶的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前臨床上對(duì)急性冠脈綜合征的診斷與評(píng)估主要應(yīng)用心肌酶譜等指標(biāo)。此類指標(biāo) 的水平通常會(huì)在心肌發(fā)生實(shí)質(zhì)損傷后發(fā)生明顯升高，因此，該類指標(biāo)不能對(duì)心血管疾病的 發(fā)生提供早期預(yù)警。髓過氧化物酶是由人中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種有酶活性的血 色素蛋白，其分子量約為118kDa，由一對(duì)重鏈和輕鏈組成。通常合成后存于中性粒細(xì)胞的嗜 天青顆粒中，但在炎癥條件下可釋放入血，可將氯化物和過氧化氫催化成次氯酸鹽，參與殺 菌效應(yīng)。但髓過氧化物酶能氧化低密度脂蛋白膽固醇，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化；該蛋 白也可激活金屬蛋白酶（MMPs)，并促進(jìn)粥樣硬化斑表面失穩(wěn)定、甚至破裂；可降低NO的含 量及生物利用度，影響其對(duì)血管擴(kuò)張和抗炎功能的效應(yīng)。近年來的研究表明，髓過氧化物酶 參與了心臟冠脈疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，是急性冠脈綜合征發(fā)生的重要原因，其活性的水平 在一定程度反應(yīng)了冠脈疾病的活化程度。目前，國(guó)內(nèi)各臨床實(shí)驗(yàn)室已認(rèn)識(shí)到髓過氧化物酶 檢測(cè)在急性冠脈綜合征診斷中的重要價(jià)值，并開始嘗試對(duì)其開展檢測(cè)，并用于急性冠脈綜 合征等炎癥疾病的診斷。
[0003] 當(dāng)前對(duì)于髓過氧化物酶的檢測(cè)主要有二種方法，一種是酶活性檢測(cè)方法，即利用 髓過氧化物酶的過氧化物酶活性進(jìn)行檢測(cè)；另一種是利用髓過氧化物酶的抗原性建立的酶 聯(lián)免疫檢測(cè)法。第一種方法的主要特點(diǎn)是可檢測(cè)髓過氧化物酶的活性，但方法靈敏度差、且 多為定性檢測(cè)。而酶聯(lián)免疫檢測(cè)法快速且可定量分析，但常規(guī)方法中用辣根過氧化物酶標(biāo) 記的抗體直接檢測(cè)，并采用髓過氧化物酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，因此，其檢測(cè)靈敏度低；易受髓過氧 化物酶本身過氧化物酶的干擾，特異性差；同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏、高特異、重復(fù)性好、易操作的臨床用 髓過氧化物酶檢測(cè)試劑盒。
[0005] 本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，包括抗髓過氧化物酶抗體預(yù)包的酶 標(biāo)板、生物素化抗髓過氧化物酶抗體、親和素化堿性磷酸酶、堿性磷酸酶底物液、髓過氧化 物酶標(biāo)準(zhǔn)品、髓過氧化物酶質(zhì)控品、樣本稀釋液和酶反應(yīng)終止液；
[0006] 其中，所述髓過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品和髓過氧化物酶質(zhì)控品均為重組的髓過氧化物酶 肽抗原；所述髓過氧化物酶質(zhì)控品用于校準(zhǔn)、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0007] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述抗髓過氧化物酶抗體 預(yù)包的酶標(biāo)板按以下步驟制備：
[0008] 將稀釋的羊抗人髓過氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板中，孵育8-12小時(shí)； 將抗體吸出后，用洗滌緩沖液洗加樣孔三遍；加入封閉液靜置4小時(shí)；棄去孔中液體，冷風(fēng) 機(jī)吹干后，真空包裝，置4°C保存；
[0009] 所述稀釋的羊抗人髓過氧化物酶多抗，濃度為10yg/mL;
[0010] 所述洗滌緩沖液為加〇? 08 %吐溫-20的0?ImM磷酸緩沖液，pH為7. 4 ;
[0011] 所述封閉液為含5%牛白蛋白和5%人白蛋白的pH7. 4的0.ImM磷酸緩沖液，以上 所述百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0012] 更進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述羊抗人髓過氧化物 酶多抗為髓過氧化物酶全蛋白免疫羊后，純化、制備的多抗。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述生物素化抗髓過氧化 物酶抗體按以下步驟制備：
[0014] 將兔抗人髓過氧化物酶多抗采用N-羥基丁二酰亞胺（生物素）進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記；用 磷酸緩沖液透析去除游離生物素后，即制得生物素化抗髓過氧化物酶抗體；
[0015] 將制得的生物素化抗髓過氧化物酶抗體用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻 酸鈉和0. 05 %疊氮鈉的0.IM磷酸緩沖液按I:20-200稀釋，-20 °C保存；
[0016] 所述磷酸緩沖液pH為7. 4,以上百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述親和素化堿性磷酸酶 按以下步驟制備：
[0018] 將堿性磷酸酶用鏈霉親和素采用戊二醛法進(jìn)行標(biāo)記；透析去除游離鏈霉親和素 后，即制得親和素化堿性磷酸酶；
[0019] 將制得的親和素化堿性磷酸酶用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻酸鈉和 0. 05%疊氮鈉的0.ImM磷酸緩沖液按1:20-200稀釋，-20°C保存；
[0020] 所述磷酸緩沖液pH為7. 4,以上所述百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述堿性磷酸酶底物液按 以下步驟制備：將PNPP以IOmM的濃度溶于含ImM1%(：12的0.IM二乙醇胺緩沖液（pH9. 8) 中，即制得堿性磷酸酶底物液。
[0022] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述樣本稀釋液為含0. 5% 牛白蛋白的〇.ImM磷酸緩沖液，pH為7. 4。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述酶反應(yīng)終止液為3N的 NaOH0
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述髓過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品 的濃度分別為 30ng/mL、15ng/mL、7. 5ng/mL、3. 75ng/mL、l. 87ng/mL。
[0025] 進(jìn)一步，本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒，所述生物素化抗髓過氧化 物酶抗體和親和素化堿性磷酸酶應(yīng)用的稀釋比均為1:2000,稀釋液均為含20%甘油、10% 牛白蛋白、〇. 5 %海藻酸鈉和0. 05 %疊氮鈉的0.ImM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液pH為 7. 4,以上所述百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0026] 本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：
[0027] 1、本發(fā)明的臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒中采用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物， 替代常規(guī)方法中的辣根過氧化物酶，避免了髓過氧化物酶本身的干擾，提高了檢測(cè)的特異 性；本發(fā)明在檢測(cè)體系中采用生物素-親和素增敏系統(tǒng)整合，提高了檢測(cè)靈敏度；同時(shí)，標(biāo) 準(zhǔn)品采用重組髓過氧化物酶肽，由于重組髓過氧化物酶肽表位比較單一，結(jié)合特異性更好， 因此提高了標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的重復(fù)性和定量檢測(cè)的穩(wěn)定性，降低了成本。
[0028] 2、經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)區(qū)間為0. 233-30ng/ml;無論是高濃度樣本， 還是低濃度樣本，其批內(nèi)CV值均小于7%，方法學(xué)精密度良好；試劑盒的回收效率平均為 101. 39%，說明準(zhǔn)確度良好。
[0029] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒作進(jìn)一 步說明。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒的技術(shù)原理圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中采用不同包被抗體濃度的檢測(cè)結(jié)果曲線圖；
[0032] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中采用不同檢測(cè)抗體濃度的檢測(cè)結(jié)果曲線圖；
[0033] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中采用不同堿性磷酸酶濃度的檢測(cè)結(jié)果曲線圖；
[0034] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中采用不同抗原和標(biāo)準(zhǔn)品的孵育時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果曲線圖；
[0035] 圖6為本發(fā)明臨床用定量檢測(cè)髓過氧化物酶試劑盒對(duì)髓過氧化物酶的檢測(cè)區(qū)間 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 本實(shí)施例的臨床用定量檢測(cè)髓過氧