蛋白制劑的高效液相色譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白制劑的高效液相色譜檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白制劑中，通常需要加入一些輔料，例如：甘露醇作為賦型劑，蔗糖作為穩(wěn)定劑， 三羥甲基氨基甲烷作為緩沖劑體系。為了控制蛋白制劑的成品質(zhì)量，通常需要對(duì)其組分含 量進(jìn)行檢測(cè)；但由于其中含有甘露醇、蔗糖等輔料，檢測(cè)時(shí)各組分之間存在干擾，導(dǎo)致其檢 測(cè)方法往往比較繁瑣、復(fù)雜。
[0003]目前，蛋白制劑的檢測(cè)方法均需要采用兩種不同的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)對(duì) 蛋白制劑中各個(gè)組分的分離，以避免各組分之間的干擾。例如，柏兆方等采用超高效納升液 相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白進(jìn)行了分析，它 采用特殊的富集柱和分離柱，并采用兩種不同的流動(dòng)相（流動(dòng)相A:含0. 1%甲酸的水溶液； 流動(dòng)相B:含0. 1 %甲酸的乙氰）進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體 融合蛋白中各個(gè)組分的有效分離，避免各組分之間的干擾（柏兆方，林碧蓉，李萍，李衛(wèi)華， 劉炳玉，王紅霞.《超高效納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定重組人II型腫瘤壞死因子受 體-抗體融合蛋白》.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2009年7月，第37卷，第7期：1025~1028.)。
[0004] 姚雪靜等建立了一種測(cè)定注射用重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白 含量的方法，也是采用特殊的色譜柱，并采用兩種不同的流動(dòng)相（流動(dòng)相A液：含0. 1 %三 氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液）進(jìn)行梯度洗脫（A液從75%漸 變至60%，同時(shí)B液從25%漸變至40%，洗脫時(shí)間：15min)(姚雪靜，李壯林.《RP-HPLC法 測(cè)定注射用重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白的含量》.中國(guó)藥房，2012年， 第23卷，第33期.）。
[0005] 高凱等建立了一種重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白的質(zhì)控方法， 它使用AgilentZorbax300SBC18(5ym，4.6mmX250mm)色譜柱，采用兩種不同的流動(dòng)相 (流動(dòng)相A液：含0. 1 %三氟醋酸的水溶液；流動(dòng)相B液：含0. 1 %三氟醋酸的乙腈溶液）進(jìn) 行梯度洗脫（洗脫梯度為：〇~15min，B液：30%~45% ;16~20min，B液：45%~30% ) (高凱，陶嘉，史新昌，裴德寧，王蘭，李響，饒春明，王軍志.《重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子受 體-抗體融合蛋白質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立》.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2012年3月，第25 卷，第3期.）。
[0006] 可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)蛋白制劑的方法都比較繁瑣、復(fù)雜，均需要采用兩種不同的流 動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白制劑中各個(gè)組分的分離。
[0007] 因此，對(duì)于蛋白制劑而言，需要發(fā)明一種簡(jiǎn)便并能有效避免各組分之間相互干擾、 實(shí)現(xiàn)對(duì)各組分有效檢測(cè)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供蛋白制劑的一種高效液相色譜檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明提供的蛋白制劑的高效液相色譜檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0010] a、取蛋白制劑，用水溶解后，流動(dòng)相稀釋，制成供試品溶液；
[0011] b、取對(duì)照品，用水洛解，制成對(duì)照品洛液；
[0012] c、采用高效液相色譜分別對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：
[0013] 色譜柱為氨基柱；流動(dòng)相為乙腈-水溶液，乙腈與水的體積比為（65 :35)~（80: 20)〇
[0014] 進(jìn)一步的，步驟a中，蛋白制劑為注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合 蛋白。
[0015] 進(jìn)一步的，注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白包括以下組分： 重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白、甘露醇、蔗糖和三羥甲基氨基甲烷。
[0016] 進(jìn)一步的，注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白包括以下重量份 配比的組分：重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白25份、甘露醇40份、蔗糖10份 和三羥甲基氨基甲烷1.2份。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟a中，供試品溶液的濃度為2. 5mg/ml。
[0018] 進(jìn)一步的，步驟b中，對(duì)照品為甘露醇、蔗糖、重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體 融合蛋白、三羥甲基氨基甲烷中的任意一種或兩種以上。
[0019] 進(jìn)一步的，步驟c中，色譜柱為AgilentZORBAXCarbohydrate，規(guī)格為 4. 6_X250mm，填充劑粒徑為5μm。
[0020] 進(jìn)一步的，步驟C中，乙腈與水的體積比為（75 :25)~（80 :20)。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟c中，流動(dòng)相的流速為1~1. 5ml/min;優(yōu)選的，流動(dòng)相的流速為 L5ml/min〇
[0022] 進(jìn)一步的，步驟c中，色譜柱的柱溫為30°C;檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器池 溫度為35°C;上樣體積為10μ1~20μ1。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟c中，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中甘露醇、蔗糖、重組人II型 腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白和/或三羥甲基氨基甲烷的含量。
[0024] 本發(fā)明蛋白制劑的檢測(cè)方法，無(wú)需采用梯度洗脫程序，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白制劑中蔗 糖、甘露醇等組分的有效分離，蔗糖和甘露醇之間的分離度高，符合《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操 作規(guī)范2010年版》及《中國(guó)藥典2010年版》的規(guī)定（規(guī)定要求大于1. 5)，避免了各組分之 間的干擾影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確 性高，非常適合用于對(duì)蛋白制劑中甘露醇、蔗糖等組分的定性和定量檢測(cè)。
[0025] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0026] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1、試驗(yàn)例1條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果：(a)供試品溶液；(b)蔗糖對(duì)照 品；（c)甘露醇對(duì)照品。
[0028] 圖2、試驗(yàn)例2條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果：(a)供試品溶液；(b)融合蛋白 原液對(duì)照品。
[0029] 圖3、試驗(yàn)例3條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖4、試驗(yàn)例4條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果。
[0031] 圖5、試驗(yàn)例5條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果：曲線1 :供試品溶液，曲線2 :融 合蛋白原液對(duì)照品。
[0032] 圖6、試驗(yàn)例6條件下對(duì)融合蛋白制劑的檢測(cè)結(jié)果：曲線1 :供試品溶液，曲線2 :融 合蛋白原液對(duì)照品。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買市售產(chǎn)品獲得。
[0034] 注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白：含有重組人II型腫瘤壞死 因子受體-抗體融合蛋白（rhTNFR:Fc)、甘露醇、蔗糖和三羥甲基氨基甲烷；目前已經(jīng)上市 的產(chǎn)品有美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的恩利-依那西普、上海中信國(guó)健藥業(yè)生產(chǎn)的益賽普和上海賽 金生物醫(yī)藥生產(chǎn)的強(qiáng)克等。
[0035] 融合蛋白原液：重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] (1)制備供試品溶液
[0038] 取注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，用1. 0ml超凈水復(fù)溶 后，流動(dòng)相稀釋10倍，制成供試品溶液，終濃度為2. 5mg/ml;
[0039] (2)高效液相色譜檢測(cè)
[0040] 采用高效液相色譜對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，供試品溶液的上樣體積為10μ1，色譜 條件為：色譜柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相為氨基柱；色譜柱的填充劑粒徑為 5μm，規(guī)格為4. 6mmX250mm;流動(dòng)相：乙腈水溶液，乙腈與水的體積比為65 :35 ;流動(dòng)相的 流速：lml/min;色譜柱溫：30°C;檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器池溫度為35°C。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] (1)制備供試品溶液
[0043] 取注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，用1. 0ml超凈水復(fù)溶 后，流動(dòng)相稀釋10倍，制成供試品溶液，終濃度為2. 5mg/ml;
[0044] (2)高效液相色譜檢測(cè)
[0045] 采用高效液相色譜對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，供試品溶液的上樣體積為10μ1，色譜 條件為：色譜柱：AgilentZORBAXCarbohydrate，固定相為氨基柱；色譜柱的填充劑粒徑為 5μm，規(guī)格為4. 6mmX250