一種鑒別診斷急性支原體、細(xì)菌和病毒感染的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及試劑盒診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種能夠鑒別診斷急性支原體、細(xì)菌或病毒感染的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在臨床急性呼吸/消化道感染患者中，絕大多數(shù)是由細(xì)菌、支原體和病毒感染所致，其中呼吸道感染支原體所占比例最大、病毒次之、細(xì)菌最小。上述三種病原體對(duì)抗生素的敏感性各不相同:其中細(xì)菌具有細(xì)胞壁，對(duì)干擾細(xì)胞壁合成的青霉素和頭孢霉素類(lèi)抗生素敏感；支原體無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)干擾蛋白質(zhì)合成的紅霉素和螺旋霉素類(lèi)抗生素敏感，而對(duì)青霉素和頭孢霉素類(lèi)抗生素抵抗；病毒是一類(lèi)非細(xì)胞型微生物，只含一種類(lèi)型核酸(DNA或RNA)和相關(guān)衣殼蛋白，它們對(duì)各類(lèi)抗生素抵抗，即病毒感染后用抗生素治療無(wú)效。若能及時(shí)準(zhǔn)確對(duì)上述病原體進(jìn)行鑒別診斷，則可有效指導(dǎo)抗生素在臨床的合理使用。
[0003]濫用或不適當(dāng)使用抗生素是誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要原因。歐盟國(guó)家統(tǒng)計(jì)每年因細(xì)菌耐藥導(dǎo)致死亡的人數(shù)約2.5萬(wàn)，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)15億歐元；我國(guó)是濫用抗生素較為嚴(yán)重的國(guó)家之一，每年約8萬(wàn)人因?yàn)E用抗菌藥物而死亡。濫用抗生素造成細(xì)菌耐藥的原因很多，其中臨床缺乏快速、簡(jiǎn)便、有效鑒別診斷急性細(xì)菌、支原體和病毒感染的檢測(cè)方法是重要原因之一。并由此導(dǎo)致急性呼吸/消化道患者特別是病情變化急劇的嬰幼兒患者入院就診后，醫(yī)務(wù)工作者為迅速控制病情發(fā)展保證患者生命安全，同時(shí)也為了避免出現(xiàn)醫(yī)患糾紛或承擔(dān)萬(wàn)一發(fā)生嚴(yán)重后果的責(zé)任，通常大多不加區(qū)分地采用抗生素進(jìn)行治療，此種情況在基層醫(yī)療單位更為普遍和嚴(yán)重。因此研制一種能夠快速有效鑒別診斷臨床急性呼吸/消化道支原體、細(xì)菌和病毒感染的新方法，對(duì)克服上述抗生素濫用或使用不當(dāng)?shù)尼t(yī)療現(xiàn)狀具有非常重要的意義。
[0004]傳統(tǒng)病原體分離培養(yǎng)方法是鑒別診斷不同病原微生物感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種檢測(cè)方法所需時(shí)間長(zhǎng)(多7天)，不能滿(mǎn)足臨床對(duì)病原體快速鑒別診斷的需求；此外，抗生素在臨床廣泛而不適當(dāng)?shù)氖褂靡矊?dǎo)致該法對(duì)病原體的陽(yáng)性檢出率明顯下降。常規(guī)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)方法對(duì)鑒別急性細(xì)菌與病毒感染有一定意義，鑒于人嗜中性粒細(xì)胞正常值介于4000-10000個(gè)/mm3之間，因此只有嗜中性粒細(xì)胞數(shù)大于10000個(gè)/mm3時(shí)才對(duì)急性細(xì)菌性感染具有明確診斷意義，此外該法雖然簡(jiǎn)單，但仍需制備血涂片并在顯微鏡下計(jì)數(shù)才能完成。
[0005]C-反應(yīng)蛋白(c-reactive protein, CRP)是 Til let 等(1930 年)在急性炎癥患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種能與肺炎球菌細(xì)胞壁C-多糖結(jié)合發(fā)生反應(yīng)的蛋白。CRP作為一種急性期反應(yīng)蛋白在正常人血漿中含量較低(〈10 μ g/ml)，在急性感染、創(chuàng)傷、某些心血管疾病或發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤時(shí)其含量顯著升高。早期研究發(fā)現(xiàn)，急性細(xì)菌感染患者血清中CRP濃度顯著升高，而在急性病毒感染時(shí)患者血清中CRP濃度變化不大。因此，曾將CRP濃度升高作為臨床鑒別診斷急性細(xì)菌感染還是急性病毒感染的一個(gè)指標(biāo)。隨后大量臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除急性細(xì)菌感染患者外，相當(dāng)數(shù)量急性病毒和支原體感染患者血清中CRP濃度也顯著升高。目前認(rèn)為患者血清CRP濃度升高對(duì)鑒別急性細(xì)菌感染還是急性病毒感染僅有一定的輔助診斷意義。
[0006]降|丐素原(procalcitonin，PCT)是Jacbbs等(1981年)首次在重癥感染患者血楽中發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，此種糖蛋白在健康人血漿中含量極低(〈0.5ng/ml)，幾乎檢測(cè)不到。1993年Assicot首次報(bào)道在重癥細(xì)菌患者感染血漿中PCT含量顯著升高，而在重癥病毒和支原體感染患者血漿中PCT含量不升高或輕微升高。此后PCT含量顯著升高就成為重癥細(xì)菌感染、敗血癥或膿毒血癥的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)，用于臨床診斷和指導(dǎo)抗生素的合理使用。發(fā)明人檢測(cè)發(fā)現(xiàn)急性重癥細(xì)菌性肺炎患者血清中PCT含量顯著升高，而在急性輕癥細(xì)菌性肺炎與急性支原體或病毒性肺炎患者血清中的PCT含量無(wú)明顯差異。上述結(jié)果表明血漿/血清中PCT含量顯著升高對(duì)臨床重癥細(xì)菌感染的診斷具有重要意義，而對(duì)臨床輕癥細(xì)菌感染與輕癥病毒或支原體感染沒(méi)有鑒別診斷意義。
[0007]脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidebinding protein, LBP)是 Tobias 等(1986年)首次從急性炎癥反應(yīng)兔血清中分離純化的一種陽(yáng)離子蛋白，因其能與細(xì)菌脂多糖(LPS)結(jié)合故名。隨后Roeder等(1989年)又從人和其他動(dòng)物體內(nèi)分離獲得各自的脂多糖結(jié)合蛋白。人LBP作為I型急性期反應(yīng)蛋白在正常人血漿中含量較低(5-10yg/ml)，感染時(shí)其含量顯著升高。發(fā)明人檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，急性細(xì)菌性肺炎患者血清中LBP含量為28.614±7.280 ;急性支原體肺炎患者血清中LBP含量為30.601±13.015 ;急性病毒性肺炎患者血清中LBP含量為26.301 ±7.128。上述研究結(jié)果表明:人血液中LBP作為一種急性感染相關(guān)生物標(biāo)志物，有可能用于臨床急性感染性疾病的診斷，而不適用于對(duì)急性細(xì)菌、支原體和病毒感染的鑒別診斷。
[0008]血小板衍生的生長(zhǎng)因子(plateletderived growth factor, FOGF)是Antoniades等(1979年)首次從人血小板中分離純化的一種分子量為31KD糖蛋白。此種糖蛋白由兩條肽鏈組成，具有三種不同的二聚體結(jié)構(gòu)，即H)GF-AA、roGF-BB和TOGF-AB。最初發(fā)現(xiàn)TOGF以α顆粒形式存在于血小板中，接受刺激后可迅速釋放出來(lái)對(duì)相鄰結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生促有絲分裂效應(yīng)，啟動(dòng)和促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)。隨后證實(shí)體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞是主要合成分泌TOGF的細(xì)胞，此外成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝星形細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞也可合成分泌TOGF。動(dòng)物和臨床研究發(fā)現(xiàn)在低氧壓、凝血酶、某些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子作用下，不僅能夠誘導(dǎo)結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生TOGF啟動(dòng)和促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)，還能(1)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生roGF，以自分泌方式促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)形成腫瘤；(2)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生roGF，以旁分泌方式參與和促進(jìn)肺纖維化的形成(3)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和相關(guān)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生roGF，以自分泌和旁分泌方式參與和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。此外發(fā)現(xiàn)roGF水平升高還與肝纖維化、骨髓纖維化、系統(tǒng)性硬化癥、哮喘和妊娠反應(yīng)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但迄今為止尚未見(jiàn)到roGF水平升高與急性感染性疾病相關(guān)的研究報(bào)告。
[0009]呼吸道和消化道是病原體侵入機(jī)體的重要門(mén)戶(hù)，鑒于(1)不同病原體對(duì)肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的刺激作用可能有所不同；
(2)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體反復(fù)感染可使大鼠肺組織中roGF-BB表達(dá)水平顯著升高，并由此導(dǎo)致大鼠肺間質(zhì)纖維化形成；(3)申請(qǐng)人采用B1-plex懸液芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)急性支原體感染肺炎患者血清中TOGF含量較急性細(xì)菌或病毒感染肺炎患者顯著升高；申請(qǐng)人提出以人roGF作為急性感染相關(guān)生物標(biāo)志物，對(duì)臨床急性支原體、細(xì)菌和病毒感染進(jìn)行診斷或鑒別診斷的新思路、新方法。
[0010]殺菌/ 滲透增強(qiáng)蛋(bactericidal/permeability-1ncreasing protein, BPI)是Weiss等(1978年)首次從人嗜中性粒細(xì)胞中分離獲得的一種分子量為55KDa的陽(yáng)離子抗菌蛋白。隨后發(fā)現(xiàn)BPI不僅存在于人嗜中性粒細(xì)胞中，也存在于人粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中。研究證實(shí)，人BPI能與細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結(jié)合介導(dǎo)產(chǎn)生中和內(nèi)毒素(LPS)和殺傷革蘭陰性菌等抗感染免疫效應(yīng)。生理?xiàng)l件下血漿中BPI含量較低，感染時(shí)其含量顯著升高。研究表明，感染時(shí)BPI含量升高是病原體直接對(duì)粘膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞刺激作用所致。呼吸/消化/泌尿生殖道是病原體侵入人體的重要門(mén)戶(hù)。鑒于(I)不同病原體對(duì)上述相關(guān)粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的刺激作用有所不同，通常大分子顆粒性病原體對(duì)相關(guān)粘膜上皮細(xì)胞的刺激作用大于小分子可溶性病毒；(2)細(xì)菌感染后還可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞生成，并直接刺激嗜中性粒細(xì)胞高表達(dá)BPI，而病毒感染通常不能產(chǎn)生上述作用；(3)申請(qǐng)人采用BPI ELISA試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)急性細(xì)菌感染肺炎患者血清中BPI含量較急性病毒感染肺炎患者顯著升高；申請(qǐng)人提出以人BPI作為急性感染相關(guān)生物標(biāo)志物，對(duì)臨床急性細(xì)菌感染與急性病毒感染進(jìn)行診斷或鑒別診斷的新思路、新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明目的在于提供一種能夠?qū)εR床急性支原體、細(xì)菌或病毒感染進(jìn)行快速鑒別診斷的試劑盒，為指導(dǎo)醫(yī)務(wù)工作者及時(shí)準(zhǔn)確合理使用抗生素治愈相關(guān)疾病，避免濫用抗生素造成細(xì)菌耐藥提供可靠的技術(shù)支持。
[0012]本發(fā)明采用B1-plex懸液芯片技術(shù)對(duì)病原學(xué)診斷明確的93份急性肺炎患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)若以6000pg/ml的TOGF作為鑒別診斷急性支原體感染與急性病毒或細(xì)菌感染的檢測(cè)基線(xiàn)值，支原體陽(yáng)性檢出率與病毒或細(xì)菌感染后出現(xiàn)的支原體假陽(yáng)性檢出率具有非常顯著性差異；本發(fā)明還采用BPI ELISA試