體液中細胞成分的解離的制作方法
【專利說明】體液中細胞成分的解離
[0001] 本申請是申請日為2009年7月23日、發(fā)明名稱為"體液中細胞成分的解離"的發(fā) 明專利申請No. 200980129078. 0的分案申請。 【技術領域】
[0002] 本發(fā)明指通過在提供細胞成分的基本上定量解離而基本上無流體成分的沉積，沉 淀，變性，凝集及膠凝發(fā)生的條件下快速冷凍/解凍處理來處理包括細胞成分的生物流體 的方法及裝置。方法對于制備用于分析物檢測的生物樣品特別有用。 【【背景技術】】
[0003] 已在各種研究中研究血細胞的冷凍及溶血效應。Scheiwe等人 (Cry〇bi 〇l〇gyl9, 1982, p. 461-477)研究了以不同線性冷卻速度用或不用冷凍保護劑羥乙 基淀粉（HES)降至-196°C的小的玻璃毛細管中分離的及濃縮的紅細胞的懸浮液的冷凍。從 作為冷卻速度的函數(shù)的溶血的U-形曲線得出，對于例如0. 6的血細胞比容（Hct)，及在缺乏 HES的情況下，必需用大致100°C /分鐘的冷卻速度處理細胞懸浮液，以便實現(xiàn)100%溶血。 具有更低的分別〇. 4和0. 2的Hct的紅細胞懸浮液，在這些條件下產生80~90 %溶血。在 HES的存在下可實現(xiàn)50~60%的溶血率。大致5000°C /分鐘的冷卻速度顯示大致40 %溶 血。
[0004] Rapatz及Luyet以保存人紅細胞的方式研究了冷凍溫度，冷凍速度或保護 試劑（例如冷凍保護劑）對全血樣品的效應（Cryobiology 4, 1968, PP. 215-222)。 相應實驗已在具有I. 5+/-0. 5mm外徑及0· 3+/-0. 5mm的壁厚度的玻璃毛細管中進 行。在另一出版物中，作者研究了血的快速冷凍后幾種動物物種中的溶血（J. Cell. Physiol. 77, 1970, pp. 373-376)。對紅細胞溶血的新近結果也在綜述〃A review on basic researches on the cryopreservation of red blood cells〃中總結（Luyet and Rapatz，Cryobiology 6, 1970, pp. 425-482)。
[0005] 但是，無出版物應對全血樣品的冷凍給出線索，有關如何獲得來自包括細胞成分 的生物樣品的經(jīng)處理的流體，從而將含于生物樣品的基本上全部細胞成分定量解離，然而 基本上無流體成分的沉積，沉淀，變性，凝集及膠凝發(fā)生。也無在分析中使用經(jīng)處理的全血 的導向。
[0006] 在來自生物流體的樣品中的分析物的測定常要求復雜的及繁瑣的預處理過程，以 便去除來自流體樣品的細胞成分。別的細胞成分或沉積物將阻塞樣品注射裝置，毛細管，分 離柱等。例如，全血含成分，即紅細胞，白細胞及血小板。為測定血樣品中的分析物，這些細 胞成分常必需通過預處理過程（例如離心，過濾或沉積）除去。
[0007] 關于代表主要血級分的紅細胞，樣品預處理涉及使用（生物）化學試劑，滲透壓休 克（即通過低-或高滲溶液）和/或機械處理溶血。但是，溶血產生由血漿及所謂的源于 紅細胞的血影組成的裂解產物。這些血影耗盡了血紅蛋白及仍具有天然的紅細胞的尺寸。 這意味著，也必需在分析之前通過離心，過濾或沉積除去血影。
[0008] 但是，這些過程常難以整合進自動化的測試形式。尤其是在靶分析物存在于細胞 成分的胞質溶膠或膜的情況中，例如紅細胞中的免疫-抑制藥物。此情況中，將細胞成分在 添加裂解試劑之前通過離心和/或過濾分離富含，或通過將變性劑（例如ZnS0 4&乙腈的 混合物）添加到原樣品來將它們變性，然后離心。
[0009] 剛剛提議用于處理用于分析物測定的生物流體的新方法。此方法基于熱處理，及 適宜于自動化的過程（W0 2008/003451)。但是，此方法強烈依賴于小的溫度范圍的溫度，從 而需要復雜的溫度控制。處理也被〖_，發(fā)生凝固的溫度限制。此外，添加有機修飾物（例 如甲醇）影響加熱處理從而處理參數(shù)。而且，非每含于生物流體的分析物在推薦的熱處理 期間穩(wěn)定。因此，如果要測定熱不穩(wěn)定的分析物，此方法不太優(yōu)選。
[0010] 【發(fā)明概述】
[0011] 由此，本發(fā)明的課題是提供在以下條件下包括細胞成分的生物流體的新處理方 法：
[0012] (i)提供所述細胞成分的基本上定量解離，
[0013] (ii)不導致流體成分的實質性沉積，沉淀，變性，凝集及膠凝，
[0014] (iii)不局限于小的溫度范圍，及
[0015] (iv)允許添加其他不影響處理的流體，例如甲醇等。
[0016] 以上問題的解決通過提供權利要求中表征的實施方式來實現(xiàn)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供在以下條件下產生經(jīng)處理的生物流體的方法：
[0018] (i)提供所述細胞成分的基本上定量解離，及
[0019] (ii)不導致流體成分的實質性沉積，沉淀，變性，凝集及膠凝，
[0020] 包括下列步驟：
[0021] (a)提供包括細胞成分的生物流體，
[0022] (b)冷凍所述生物流體，及
[0023] (c)解凍步驟（b)的冷凍的流體。
[0024] 本發(fā)明的再一方面是經(jīng)處理的生物流體，包括基本上定量解離的細胞成分，其基 本上無沉積，沉淀，變性，凝集及膠凝產物。優(yōu)選地，生物流體不稀釋，即處理期間或之前無 其他流體加入。
[0025] 本發(fā)明又一方面是在生物流體樣品測定分析物的方法，其中所述生物流體如上所 述處理，及在經(jīng)處理的生物流體中測定分析物。
[0026] 本發(fā)明又一方面是處理包括細胞成分的生物流體的裝置，其中所述裝置包括：
[0027] (a)流體處理單元，其至少部分可冷凍/可加熱，
[0028] (b)冷卻元件，其用于冷凍預定部分的流體處理單元，
[0029] (C)加熱元件，其用于加熱預定部分的流體處理單元，
[0030] (d)任選流體運輸元件，例如抽栗元件，
[0031] (e)控制元件，其用于在以下條件下控制流體的冷凍/加熱
[0032] (i)提供所述細胞成分的基本上定量解離，及
[0033] (ii)不導致流體成分的實質性沉積，沉淀，變性，凝集及膠凝，
[0034] (f)任選清潔元件，及
[0035] (g)任選樣品分析元件。
[0036] 【發(fā)明詳述】
[0037] 意外地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可通過在預定時間及溫度條件下冷凍/解凍處理來實現(xiàn) 生物樣品中細胞成分，優(yōu)選來自高等生物的細胞或細胞群集，更優(yōu)選動物細胞（例如哺乳 動物細胞（包括人細胞）），及最優(yōu)選血細胞（例如紅細胞，白細胞和/或血小板）的完全解 離。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟（b)及（c)的冷凍/解凍處理可進行至少一次，優(yōu)選兩次或 最優(yōu)選3次或甚至更多次。
[0038] 利用根據(jù)本發(fā)明的處理，將含于生物流體的細胞成分基本上定量解離，以產生無 流體成分的實質性沉積，沉淀，變性，凝集和/或膠凝的亞細胞粒子。由此，本發(fā)明的經(jīng)處理 的生物流體包括亞細胞粒子，以及包括離子，氣體，低分子物質（如糖，及蛋白）的液體成 分。
[0039] 本發(fā)明利用的〃生物流體〃涉及包括細胞成分及液體成分的生物懸浮液，及其選 自體液或細胞培養(yǎng)液。細胞成分是細胞，細胞群集或細胞影，液體成分是血漿，尿，唾液等或 細胞培養(yǎng)基。體液的特定實施例是全血，尿，腦脊液，唾液，淋巴液，及細胞培養(yǎng)液的特定實 施例是哺乳動物細胞培養(yǎng)液。
[0040] 本發(fā)明中使用的〃細胞成分〃涉及細胞，細胞群集或細胞影，特別是紅細胞影。
[0041] 在本發(fā)明中，含于經(jīng)處理的生物流體的〃亞細胞粒子〃涉及細胞碎片（例如通過 本發(fā)明的方法產生及由重封的膜的非常小的球和/或非常小的粒子構成的膜囊泡），其特 征在于，它們
[0042] (a)靜置狀態(tài)下，在至少約24小時的時間內不沉淀，及
[0043] (b)不像紅細胞影（約5~8 μπι尺寸）或完整的細胞，在以約3000g重力離心至 少10分鐘的時間后不沉淀，及
[0044] (c)在以高于約IlOOOg重力離心至少20分鐘的時間后沉淀。
[0045] 含于生物樣品流體的〃細胞成分的基本上定量解離