一種牛體外受精囊胚雙重染色的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于牛體外受精生物技術領域，涉及牛體外受精囊胚的質(zhì)量評價方法，更 具體的說是一種簡便、快速的牛囊胚雙重染色方法。
【背景技術】
[0002] 自從牛IVP體系的成功建立開始，人們試圖從不同的角度對這一體系進行改進， 例如改變培養(yǎng)系統(tǒng)、添加脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子（lipid metabolic regulators).、添加 cAMP調(diào)節(jié)因子（Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) modulators)等，但和體內(nèi)胚胎 相比牛體外胚胎的質(zhì)量仍然較差，不僅囊胚細胞數(shù)較少而且移植妊娠率也不高。這使得人 們認識到提高牛胚胎質(zhì)量的必要性，為此胚胎質(zhì)量的檢驗逐漸成為評估體外培養(yǎng)體系好壞 的重要指標之一。與傳統(tǒng)單一染色方法相比，雙重染色方法能清晰的將囊胚內(nèi)細胞團（ICM) 和滋養(yǎng)層細胞（TE)區(qū)分開來，在評估上具有更高的準確性。目前的囊胚雙重染色方法是 在Thous等利用TritonX-100對囊胚雙重染色的基礎上建立起來的，但是存在的最大問 題是程序繁瑣，每步染色花費時間多，整個染色程序下來最少在47min以上，因此染色時間 長(李瑞岐，桑潤滋.以囊胚雙重染色方法檢驗果糖對牛胚胎早期發(fā)育效果的影響[J]. 中國畜牧雜志，2010 (9): 23-25;李榮，劉穎，趙興波，等.無血清培養(yǎng)基IVDlOl和 G1/G2在牛體細胞核移植中的應用研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008, 39(11) :1487-1492; Thouas G A, Korfiatis N A，F(xiàn)rench A J， et al. Simplified technique for differential staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine blastocysts[J]. Reproductive biomedicine online, 2001，3(1): 25-29. )〇
[0003] 通常在評價囊胚質(zhì)量時，因胚胎日齡、發(fā)育階段不同，需要對胚胎進行分類，多批 次染色，因此染色花費時間長，效率低，并可能影響染色的效果。
[0004] 為了降低囊胚雙重染色所需時間，提高效率，我們經(jīng)過試驗摸索，對牛體外受精囊 胚的雙重染色步驟進行了優(yōu)化，3min即可完成染色，而以前的報道中最少需要47min。因此 大大降低了囊胚雙重染色所需時間，提高了效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種牛體外受精囊胚雙重染色的方法，包括（1)卵 母細胞的采集；（2)體外成熟培養(yǎng)；（3)體外受精；（4)胚胎的體外培養(yǎng)；（5)囊胚雙重染 色五個步驟，其特征在于步驟（5)囊胚雙重染色：它是將培養(yǎng)至7-9d的牛囊胚用0. 5%(w/ w) Pronase (鏈霉蛋白酶）處理囊胚55s，后于PBS (磷酸緩沖液）中洗2-3遍，在IOOPg/ ml PI (碘化丙啶）（l%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS)中染色20s，于PBS中 洗2-3遍后移入45Pg/ml Hoechst33342 (雙苯酰亞胺）中染色50s，用PBS洗2-3遍后進行 壓片，壓片后置于倒置熒光顯微鏡紫外光下觀察照相，囊胚內(nèi)細胞團（ICM)細胞核呈藍色， 滋養(yǎng)層（TE)細胞細胞核呈紅色。
[0006] 本發(fā)明更加詳細的描述如下： 1. 卵母細胞的采集 牛卵巢取自屠宰場，卵巢置于37°C加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，2~3h運回實驗 室，除盡周圍脂肪組織，然后用加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水沖洗5~6次，用采卵液抽吸 法吸取直徑2~8mm的卵泡，根據(jù)實驗不同的需求挑選裸卵、半裸卵及具有三層及其以上卵 丘的卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus oocyte complexes，COCs)用于試驗； 采卵液：TCM-199(組織培養(yǎng)基）+5% FBS(胎牛血清）+3〇μ8/πι1 !feparin(肝素 鈉）+4.766g/l Hepes (4-輕乙基哌嗪乙磺酸） 2. 體外成熟培養(yǎng) 將收集的卵母細胞用成熟液洗3遍，然后每40-60個移入平衡至少2h的Iml成熟液中 (四孔板)，于5%C02、95%空氣、38. 5°C、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23~24h ;若卵丘細胞共 培養(yǎng)則用微滴法（ιοομL)，以排出第一極體為卵母細胞成熟的標志； 成熟液：TCM-199+10% FBS+l(^g/ml FSH(促卵泡激素）+2〇μ8/πι1 LH(促黃體素）+?μ8/ ml E2 (雌二醇）； 3. 體外受精 受精液為 IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan，用直接離心法對精子進行洗滌，即用6ml受精液稀釋解凍的精液并于2000r/min下 離心7分鐘，棄去上清液，重復一次后用受精液稀釋精子，密度為I X 106~6 X IO6個/ml，然 后放入0)2培養(yǎng)箱中備用，IVF-100受精時間為6h ; 4. 胚胎的體外培養(yǎng) 將經(jīng)體外受精的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍，并用Iml移液管部分或全部去除 周圍的卵丘細胞，以10枚假定受精卵/ιοομL微滴將假定受精卵隨機平等的移入平衡至少 2h的微滴中進行體外培養(yǎng)，從體外受精開始算起，第48h對各組卵裂率進行觀察與記錄，第 7-9d對各組囊胚率進行觀察與記錄，中途不進行換液，胚胎培養(yǎng)液為CRlaa。
[0007] ?囊胚雙重染色 我們對傳統(tǒng)的囊胚雙重染色方法進行了改進，最重要的改進就是在保證染色效果的前 提下，縮短相應步驟的操作時間，具體方法如下：將培養(yǎng)至7~9d的牛囊胚用0. 5% Pronase (鏈霉蛋白酶）處理囊胚55s，后于PBS (磷酸緩沖液）中洗2~3遍，在lOOPg/ml PI (碘 化丙啶）（l%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS)中染色20s，于PBS中洗2~3遍后 移入45Pg/ml Hoechst33342(雙苯酰亞胺)中染色50s，用PBS洗2~3遍后進行壓片，壓片后 置于倒置熒光顯微鏡紫外光下觀察照相，囊胚內(nèi)細胞團（ICM)細胞核呈藍色，滋養(yǎng)層（TE) 細胞細胞核呈紅色。
[0008] 本發(fā)明重點解決了傳統(tǒng)的囊胚雙重染色法，相應步驟染色處理時間多，造成整個 染色程序時間長，效率低的問題。本發(fā)明的簡便、快速的牛囊胚雙重染色法就是優(yōu)化每一 步染色步驟，在保證染色效果的前提下，盡量縮短染色時間，從而整體減少囊胚雙重染色時 間，這一結果為簡便、快速評價囊胚質(zhì)量奠定了基礎。
[0009] 本發(fā)明公開的簡便、快速的牛囊胚雙重染色法與現(xiàn)有的技術相比所具有的優(yōu)點在 于： 通過優(yōu)化牛體外受精囊胚的雙重染色的每一步驟，在保證染色效果的前提下，盡量縮 短染色時間，3min即可完成染色，而以前的報道中最少需要47min。因此大大降低了囊胚雙 重染色所需時間，提高了效率，從而可快速對牛囊胚質(zhì)量做出評價。
[0010]
【附圖說明】： 圖1為改進的囊胚雙重染色效果圖。
[0011]
【具體實施方式】： 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，使本領域?qū)I(yè)技術人員更好的理解本發(fā) 明。實施例僅為解釋性的，絕不意味著它以任何方式限制本發(fā)明的范圍。特別加以說明的 是： TCM199 (組織培養(yǎng)基)、FCS (胎牛血清)、PBS (磷酸緩沖液）購自Gibco公司；FSH (促 卵泡激素 ）、LH (促黃體素）購自寧波激素制品廠；17β-Ε2 (雌二醇)、H〇CheSt33342 (雙苯 酰亞胺）、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、PI (碘化丙啶)、Ifepes (4-羥乙基哌嗪 乙磺酸）、Heparin(肝素鈉 )、Pronase (鏈霉蛋白酶）購自Sigma公司；IVF-100受精液 貝勾自 Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan。
[0012] 實施例1: I.材料與方法 I. I卵母細胞的采集 牛卵巢取自屠宰場，卵巢置于37°C加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，2~3h運回實驗 室，除盡周圍脂肪組織，然后用加有青霉素、鏈霉素的生理鹽水沖洗5~6次，用采卵液抽吸 法吸取直徑2~8mm的卵泡，根據(jù)實驗不同的需求挑選裸卵、半裸卵及具有三層及其以上卵 丘的卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus oocyte complexes，COCs)用于試驗； 采卵液：TCM-199(組織培養(yǎng)基）+5% FBS(胎牛血清）+3〇μ8/πι1 !feparin(肝素 鈉）+4.766g/l Hepes (4-輕乙基哌嗪乙磺酸） 1. 2體外成熟培養(yǎng) 將收集的卵母細胞用成熟液洗3遍，然后每40-60個移入平衡至少2h的Iml成熟液中 (四孔板)，于5%C02、95%空氣、38. 5°C、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23~24h ;若卵丘細胞共 培養(yǎng)則用微滴法（ιοομL)，以排出第一極體為卵母細胞成熟的標志； 成熟液：TCM-199+10% FBS+l(^g/ml FSH(促卵泡激素）+2〇μ8/πι1 LH(促黃體素）+?μ8/ ml E2 (雌二醇）； 1. 3體外受精 受精液為 IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan，用直接離心法對精子進行洗滌，即用6ml受精液稀釋解凍的精液并于2000r/min下 離心7分鐘，棄去上清液，重復一次后用受精液稀釋精子，密度為I X 106~6 X IO6個/ml，然 后放入0)2培養(yǎng)箱中備用，IVF-100受精時間為6h ; 1. 4胚胎的體外培養(yǎng) 將經(jīng)體外受精的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍，并用Iml移液管部分或全部去除 周圍的卵丘細胞，以10枚假定受精卵/ιοομL微滴將假定受精卵隨機平等的移入平衡至少 2h的微滴中進行體外培養(yǎng)，從體外受精開始算起，第48h對各組卵裂率進行觀察與記錄，第 7-9d對各組囊胚率進行觀察與記錄，中途不進行換液，胚胎培養(yǎng)液為CRlaa。
[0013] 改進的囊胚雙重染色 我們對傳統(tǒng)的囊胚雙重染色方法進行了改進，最重要的改進就是在保證染色效果的前 提下，縮短相應步驟的操作時間，具體方法如下：將培養(yǎng)至7~9d的牛囊胚用0. 5% Pronase (鏈霉蛋白酶）處理囊胚55s，后于PBS (磷酸緩沖