檢測到所述鑭系金屬離子信號響應(yīng)，則表明待測 細胞內(nèi)含有蛋白酶或表明待測細胞內(nèi)的蛋白酶具有蛋白酶活性；
[0043] 或，所述體外定量檢測的方法包括如下步驟：首先將所述基于鑭系金屬的雙功能 納米探針溶液加入到所述蛋白酶的標準品中，測定所述鑭系金屬離子的濃度，以所述蛋白 酶的標準品的濃度為橫坐標，所述鑭系金屬離子的濃度為縱坐標，建立標準曲線I ;將所述 基于鑭系金屬的雙功能納米探針溶液加入到體外的檢測樣品中，反應(yīng)，然后將所述反應(yīng)的 體系離心，取上清液，質(zhì)譜檢測上清液，測得待測樣品中鑭系金屬離子的濃度代入所述標準 方程I中，即得到所述待測樣品中蛋白酶的含量；
[0044] 或，所述細胞內(nèi)定量檢測的方法包括如下步驟：首先將所述基于鑭系金屬的雙功 能納米探針溶液加入到所述蛋白酶的標準品中，測定所述鑭系金屬離子的濃度，以所述蛋 白酶的標準品的濃度為橫坐標，所述鑭系金屬離子的濃度為縱坐標，建立標準曲線II ;將所 述基于鑭系金屬的雙功能納米探針溶液加入活細胞中，反應(yīng)，然后將孵育了所述探針的所 述活細胞進行裂解后，離心分離收集上清液，質(zhì)譜檢測上清液，測得待測細胞中鑭系金屬離 子的濃度代入所述標準方程II中，即得到所述待測細胞中蛋白酶的含量；
[0045] 或，所述細胞成像的方法包括如下步驟：培養(yǎng)皿中活細胞與所述基于鑭系金屬的 雙功能納米探針溶液孵育，然后將孵育了所述探針的所述活細胞進行洗滌后，進行細胞成 像即可。
[0046] 本發(fā)明基于鑭系金屬的雙功能納米探針的制備方法的原理如下：
[0047] 首先在堿性條件下利用BCTOT上的SO2Cl與多肽上N端的NH2能生成SO 2-順，從而 合成BCTOT修飾的多肽；之后，再通過BCTOT與Eu離子的螯合將Eu螯合到修飾在多肽上的 BCTOT上，之后，再利用多肽C端的半胱氨酸殘基上的SH與Au之間形成穩(wěn)定的Au-S鍵，將 Eu-BCTOT螯合物修飾的多肽加入到納米金溶液中（螯合物修飾的多肽與納米金按照摩爾 比3000 :1進行投料），在室溫下，到達設(shè)計反應(yīng)時間后采用離心的方式回收Eu-BCTOT螯合 物標記多肽修飾的納米金顆粒（即基于鑭系金屬的雙功能納米探針），使用去離子水對得 到的納米金顆粒清洗離心三次，去除未結(jié)合的多肽。
[0048] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0049] 1)該Eu-BCTOT標記肽段修飾的納米金顆粒，由于其中的Eu離子不僅具有獨特的 光學(xué)性質(zhì)，還具有質(zhì)譜響應(yīng)性質(zhì)，因此可通過單修飾而實現(xiàn)生物分子的雙信號響應(yīng)；
[0050] 2)由于同時具備光譜和質(zhì)譜信號響應(yīng)單標記探針還未見報道，與常規(guī)的生物分子 檢測方法相比，該納米探針采用Eu離子進行構(gòu)建，使得該探針不僅能實現(xiàn)生物分子的實時 原位可視化檢測，還能實現(xiàn)定量檢測；
[0051] 3) Eu離子在ICP-MS中的良好的響應(yīng)性能，使得Eu離子含量低至ppt水平仍可被 檢測出來，從而使得該納米探針可用于生物分子的靈敏定量分析，因此特別適合于細胞內(nèi) 表達水平較低的生物分子的檢測；
[0052] 4)Eu離子在細胞內(nèi)或者體內(nèi)是幾乎不存在的，因此利用Eu離子修飾的探針實現(xiàn) 生物分析的檢測可有效避免假陽性信號的出現(xiàn)。
【附圖說明】
[0053] 圖1為本發(fā)明基于鑭系金屬的雙功能納米探針的制備流程圖。
[0054] 圖2al)為未經(jīng)肽段修飾的納米金顆粒的透射電子顯微鏡照片；圖2a2)為本發(fā)明 提供的Eu-BCOT標記肽段修飾的納米金顆粒的透射電子顯微鏡照片；圖2bl)為未經(jīng)肽段修 飾的納米金顆粒的粒徑統(tǒng)計圖；圖2b2)為本發(fā)明提供的Eu-BCOT標記肽段修飾的納米金顆 粒的的粒徑統(tǒng)計圖。
[0055] 圖3為Eu-BCOT標記的肽段與納米金顆粒結(jié)合前后的熒光光譜圖，其中，圖3a為 Eu-BCTOT標記的肽段，圖3b為Eu-BCOT標記的肽段與納米金顆粒結(jié)合后的納米探針。
[0056] 圖4為納米探針與不同濃度的caspase-3的反應(yīng)后，焚光光譜的響應(yīng)。
[0057] 圖5為納米探針與不同濃度的caspase-3反應(yīng)后，上清中的Eu離子進行ICPMS檢 測，檢測得到的Eu信號與caspase-3濃度之間線性關(guān)系。
[0058] 圖6為納米探針（核心肽段序列為DEVD)與對照組探針（核心肽段序列為DEVG) 與HeLa細胞孵育后，再加入星孢菌素（STS)或Ac-DEVD-CHO孵育后的細胞成像圖。
【具體實施方式】
[0059] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061] 下述實施例中，肽段購于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。
[0062] 實施例1、
[0063] 利用Eu-BCTOT標記的肽段修飾納米金顆粒制備得到納米探針的實驗流程如圖1 所示。
[0064] I)Eu與BCTOT螯合條件的優(yōu)化：將一定量的EuCU容解到去離子水中后，加入到 BCTOT溶液中，在50°C下孵育一段時間后，測量體系的紫外和熒光光譜。通過對Eu與BCTOT 螯合后得到的溶液進行光譜分析，Eu-BCTOT螯合物的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為350nm和 614nm，這是Eu的特征發(fā)射光譜，說明Eu與BCTOT成功地螯合，且BCTOT對Eu的發(fā)光確實 能起到一個很好的敏化作用。
[0065] 接著，對Eu與BCTOT的最佳螯合比進行了考察，結(jié)果表明當Eu與BCTOT的摩爾比 在0. 1~10:1范圍內(nèi)時，Eu-BCTOT螯合物的熒光隨著兩者比例的增加而增加，當兩者的摩 爾比為1:1時，Eu-BCTOT螯合物的熒光達到了一個平臺。
[0066] 同時，對Eu-BCTOT螯合物的濃度進行了優(yōu)化，結(jié)果表明螯合物在濃度為10 μ M 時熒光值達到最大，當螯合物濃度比較高（100 μ Μ)或者比較低時（1 μ Μ)時，都會導(dǎo)致 Eu-BCTOT的熒光相對較弱?？赡艿脑蚴牵擡u-BCTOT濃度較低時，由于濃度效應(yīng)從而導(dǎo) 致體系的熒光較低；而當Eu-BCTOT濃度較高時，由于分子之間的自淬滅作用，使得體系中 的熒光強度變?nèi)?。因此，在沒有其它特殊說明的情況下，反應(yīng)體系中，Eu-BCTOT的濃度選為 10 μΜο
[0067] 此外，Eu-BCTOT螯合物的熒光隨著螯合時間的增加而增加，并在螯合時間為Ih 時，螯合物的熒光強度達到一個平臺，并且這個熒光值在24h內(nèi)沒有明顯的變化，說明 Eu-BCTOT螯合物是非常穩(wěn)定的。
[0068] 2)納米金顆粒的合成與表征：金納米顆粒由檸檬酸還原氯金酸得到，具體實驗步 驟為首先將50mL 0.25mM的氯金酸溶液在劇烈攪拌下加熱至回流，然后再將1.3mLl% (W/ V)的檸檬酸三鈉溶液快速加入其中，當溶液的顏色從淺黃色變成酒紅色的時候，停止加熱， 溶液在室溫下持續(xù)攪拌直至冷卻，最后將溶液轉(zhuǎn)移至4°C冰箱中保存待用。根據(jù)金納米離子 在520nm處的吸光度以及其在最大吸收峰處的摩爾吸光系數(shù)（2. 7X IO8M-1Cm 4計算得金納 米粒子的濃度為3nM。
[0069] 金納米顆粒的尺寸和分散性通過透射電子顯微鏡來表征。將20 μ L金納米顆粒溶 液滴加到碳修飾的銅網(wǎng)上，然后在室溫下干燥過夜待測。
[0070] 3)Eu-BCTOT修飾肽段的合成：首先，利用BCTOT上的SO2Cl易于肽段上的見1 2反 應(yīng)生成共價的SO2-NH的特點，從而將BCTOT首先修飾到合成的肽段上。具體操作是：稱取 2. Img BCTOT溶于0.1 M pH 9. 0的碳酸溶液中，再稱取0. 72mg的肽段溶于10