測定影響根際土壤氨基酸有效性因素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于土壤生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體是測定影響根際土壤氨基酸有效性因素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤中包含多種含氮的化合物，如無機(jī)氮、氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，除無機(jī)氮外，氨基酸也可以作為植物生長的重要氮源。Chapin等(1993)首次發(fā)現(xiàn)無菌根的維管植物喜歡吸收氨基酸，北極苔原無菌根植物白羊毛胡子草吸收氨基酸的量至少占總吸收氮量的60%，且在以氨基酸為唯一氮源培養(yǎng)時(shí)吸收的氮及形成的生物量均比以無機(jī)氮為氮源時(shí)要多。諸多研究者通過根系短期吸收試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室有機(jī)氮源無菌培養(yǎng)試驗(yàn)、野外植物對同位素標(biāo)記有機(jī)物質(zhì)(13C，15N雙標(biāo)記)的吸收及植物組織的15N自然豐度等方法，表明許多植物可以吸收利用環(huán)境介質(zhì)中的多種氨基酸、簡單蛋白質(zhì)等有機(jī)氮化合物，而無需將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮才能被植物吸收利用。
[0003]然而，土壤中一系列因素會(huì)影響氨基酸的生物有效性，例如土壤pH、氧化還原電位、氮素組成及生物有效性、土壤礦物組成等等。這些因素錯(cuò)綜復(fù)雜，研究單一因素對氨基酸營養(yǎng)貢獻(xiàn)的影響難以準(zhǔn)確評價(jià)土壤中的交互作用，多因素多水平的試驗(yàn)工作量較大且難以實(shí)現(xiàn)。采用多種土壤綜合分析是解決這個(gè)問題的有效方法。我國幅員遼闊，植被類型及土壤類型眾多，因降雨量及溫度的巨大差異，從南到北土壤類型呈現(xiàn)明顯的地帶性。自南向北，分布著磚紅壤、赤紅壤、紅壤、黃褐土、黃棕壤、棕壤、暗棕壤、黑土、漂灰土等一系列質(zhì)地差異較大、理化性質(zhì)明顯不同的土壤。以這些土壤為基礎(chǔ)，研究氨基酸的生物有效性，就可以綜合分析影響氨基酸的生物有效性的土壤因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種測定影響根際土壤氨基酸有效性因素的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)土壤樣品采集:采集具有代表性的地帶性土壤15個(gè)，采集點(diǎn)位于典型的土壤類型帶，磚紅壤位于廣西、廣東、海南，赤紅壤位于湖南、廣西、廣東，紅壤位于江西、湖北、湖南，黃褐土、黃棕壤位于江蘇、安徽，棕壤位于河北、河南，暗棕壤、黑土、漂黑土位于東北三省，取樣時(shí)先用?產(chǎn)子去除表土的枯枝落葉層，取0-15cm的表層土壤5kg，同時(shí)準(zhǔn)確記錄取樣點(diǎn)位置及種植制度和植被類型；
(2)樣品前處理:樣品挑出石塊及根系后，過4mm篩后放置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，之后研磨過2mm篩，裝袋備用；
(3)植物種植:稱取47g風(fēng)干土壤樣品，放置于50ml離心管中，輕微震蕩離心管，避免出現(xiàn)空隙，該離心管直徑為25mm，高度為120mm，取預(yù)先放置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽的植物種子，放置于離心管的土壤中心，稱取3g相同土壤覆蓋種子，采用移液槍向土壤中緩慢添加10ml純凈水，之后將離心管放置于人工溫室中培養(yǎng)植物，根據(jù)離心管中土壤干濕度及時(shí)添加水分，且要一次澆透；
(4)添加標(biāo)記氨基酸:培養(yǎng)15-35天后，植物根系長滿整個(gè)離心管，離心管中土壤均為根際土壤，選取土壤含水量相對較低的時(shí)期，采用2mm直徑的鐵棒從上到下垂直打三個(gè)小孔，采用移液槍向土壤中添加含200 ymolL 1的13C，15N-Glycine溶液10ml，土壤含水量較低，可以使添加的含甘氨酸的液體迅速擴(kuò)散均勻，垂直打三個(gè)小孔，有利于添加的液體上下均勻擴(kuò)散；
(5)土壤植物樣品處理及測定:吸收4h后迅速將植物連同土壤從離心管中取出，將土壤與根系分離開來后，迅速用自來水沖洗根系，之后在超聲波中清洗5min，用0.5molL 1氯化鈣沖洗三次，純凈水沖洗三次，最后放置于凍干機(jī)冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏定氮儀蒸饋，最后用0.01 mol L-1硫酸滴定，采用同位素質(zhì)譜儀測定植株不同部位的15N豐度值，在處理植物樣品的同時(shí)，將土壤放于4°C冰箱中保存，之后測定土壤的理化性質(zhì)如全氮、堿解氮、有機(jī)質(zhì)、CEC、pH、土壤機(jī)械組成、水溶性各氮素類型含量、吸附態(tài)氨基酸含量等，與氨基酸吸收量進(jìn)行線性相關(guān)分析，研究影響土壤氨基酸生物有效性的主要土壤因素，因培養(yǎng)一段時(shí)間后受根際環(huán)境的影響，土壤理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生較大變化，而添加的標(biāo)記氨基酸的吸收是在理化性質(zhì)改變后，因此測定這些土壤理化指標(biāo)采用的是培養(yǎng)后的土壤。
[0005]本發(fā)明方法操作簡單，通過相關(guān)性檢測可以在復(fù)雜的因素中找到對氨基酸生物有效性顯著影響的因素，對研究及調(diào)控氨基酸的生物有效性提供了方法基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0006]圖1是氨基酸吸收量與土壤全氮含量的關(guān)系。
[0007]圖2是氨基酸吸收量與土壤堿解氮含量的關(guān)系。
[0008]圖3是氨基酸吸收量與土壤pH的關(guān)系。
[0009]圖4是氨基酸吸收量與土壤有機(jī)質(zhì)含量的關(guān)系。
[0010]圖5是氨基酸吸收量與土壤氨氮含量的關(guān)系。
[0011]圖6是氨基酸吸收量與土壤硝態(tài)氮含量的關(guān)系。
[0012]圖7是氨基酸吸收量與土壤氨基酸含量的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0014]實(shí)施例1
(1)土壤樣品采集:采集具有代表性的地帶性土壤15個(gè)，采集點(diǎn)位于典型的土壤類型帶，磚紅壤位于海南?？?，赤紅壤位于廣東湛江，紅壤位于江西上饒(兩個(gè)樣品)、廣西南寧，黃棕壤位于河南社旗，黃壤位于貴州安順，紫色土位于四川遂寧(兩個(gè)樣品)，潮土位于河南民權(quán)，褐土位于山西長治，棕壤位于山東煙臺(tái)和沈陽鐵嶺，暗棕壤位于吉林樺甸，黑土位于哈爾濱，取樣時(shí)先用?產(chǎn)子去除表土的枯枝落葉層，取0-15cm的表層土壤5kg，同時(shí)準(zhǔn)確記錄取樣點(diǎn)位置及種植制度和植被類型；
(2)樣品前處理:樣品挑出石塊及根系后，過4mm篩后放置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，之后研磨過2mm篩，裝袋備用； (3)植物種植:稱取47g風(fēng)干土壤樣品，放置于50ml離心管中，輕微震蕩離心管，避免出現(xiàn)空隙，該離心管直徑為25mm，高度為120mm，取預(yù)先放置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽的植物種子，放置于離心管的土壤中心，稱取3g相同土壤覆蓋種子，采用移液槍向土壤中緩慢添加10ml純凈水，之后將離心管放置于人工溫室中培養(yǎng)植物，根據(jù)離心管中土壤干濕度及時(shí)添加水分，且要一次澆透；
4)添加標(biāo)記氨基酸:培養(yǎng)25天后，植物根系長滿整個(gè)離心管，離心管中土壤均為根際土壤，選取土壤含水量相對較低的時(shí)期，采用2mm直徑的鐵棒從上到下垂直打三個(gè)小孔，采用移液槍向土壤中添加含200 ymolL 1的13C，15N_Glycine溶液10ml，土壤含水量較低，可以使添加的含甘氨酸的液體迅速擴(kuò)散均勻，垂直打三個(gè)小孔，有利于添加的液體上下均勻擴(kuò)散;
(5)土壤植物樣品處理及測定:吸收4h后迅速將植物連同土壤從離心管中取出，將土壤與根系分離開來后，迅速用自來水沖洗根系，之后在超聲波中清洗5min，用0.5molL 1氯化鈣沖洗三次，純凈水沖洗三次，最后放置于凍干機(jī)冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏定氮儀蒸饋，最后用0.01 mol L1硫酸滴定，采用同位素質(zhì)譜儀測定植株不同部位的15N豐度值，在處理植物樣品的同時(shí)，將土壤放于4°C冰箱中保存，之后測定土壤的全氮含量，采用線性擬合方程研究氨基酸吸收量與土壤全氮的關(guān)系，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；
從圖1可以看出，分子態(tài)氨基酸的吸收量與土壤中全氮無顯著線性相關(guān)關(guān)系，但因其R2=0.44，接近達(dá)到顯著性差異，因此認(rèn)為土壤中全氮對分子態(tài)氨基酸具有一定的影響。
[0015]實(shí)施例2
(1)土壤樣品采集:采集具有代表性的地帶性土壤15個(gè)，采集點(diǎn)位于典型的土壤類型帶，磚紅壤位于海南?？?，赤紅壤位于廣東湛江，紅壤位于江西上饒(兩個(gè)樣品)、廣西南寧，黃棕壤位于河南社旗，黃壤位于貴州安順，紫色土位于四川遂寧(兩個(gè)樣品)，潮土位于河南民權(quán)，褐土位于山西長治，棕壤位于山東煙臺(tái)和沈陽鐵嶺，暗棕壤位于吉林樺甸，黑土位于哈爾濱，取樣時(shí)先用?產(chǎn)子去除表土的枯枝落葉層，取0-15cm的表層土壤5kg，同時(shí)準(zhǔn)確記錄取樣點(diǎn)位置及種植制度和植被類型；
(2)樣品前處理:樣品挑出石塊及根系后，過4mm篩后放置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，之后研磨過2mm篩，裝袋備用；
(3)植物種植:稱取47g風(fēng)干土壤樣品，放置于50ml離心管中，輕微震蕩離心管，避免出現(xiàn)空隙，該離心管直徑為25mm，高度為120mm，取預(yù)先放置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽的植物種子，放置于離心管的土壤中心，稱取3g相同土壤覆蓋種子，采用移液槍向土壤中緩慢添加10ml純凈水，之后將離心管放置于人工溫室中培養(yǎng)植物，根據(jù)離心管中土