一種銀杏酮酯中黃酮類和有機酸類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥成分分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種銀杏酮酯中黃酮類和有機酸類 成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用，具體涉及一種銀杏酮酯中黃酮類和有機酸類藥味成分 指紋圖譜的檢測方法及其在含量測定中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，性甘，苦，澀，平，歸心、肺經(jīng)，《中藥志》中記載 銀杏葉能"斂肺氣，平咳喘，止帶池"。銀杏酮酯（Ginkgo Biloba Extract，GEB50)是我國自 主研發(fā)的新一代銀杏葉提取物產(chǎn)品，已獲得原國家二類新藥，并通過了美國臨床預(yù)審進入 IND階段，主要用于治療心腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其中，現(xiàn)已獲得我國國家食品藥品 監(jiān)督管理局批準(zhǔn)文號的銀杏酮酯的制劑共8種（銀杏酮酯原料藥，銀杏酮酯片，銀杏酮酯顆 粒，銀杏酮酯膠囊，銀杏酮酯分散片，銀杏酮酯滴丸3種）。
[0003] 我國雖是銀杏葉資源大國，但出口產(chǎn)品僅用于食品添加劑或保健品，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 不高。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高成為中藥發(fā)展的瓶頸，現(xiàn)代化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是提高國際競爭力的 前提。根據(jù)2015版《中國藥典》，目前，銀杏酮酯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項包括：制法、性狀、鑒別、 檢查（水分、熾灼殘渣、重金屬、黃酮苷元峰面積比、總銀杏酸）、含量測定（總黃酮醇苷、萜 類內(nèi)酯）、貯藏、制劑。但銀杏酮酯中仍有大部分尚不清楚的成分，只測定目標(biāo)成分含量并不 能真正反映其質(zhì)量穩(wěn)定，故指紋圖譜分析、原型黃酮苷類成分的測定日益引起關(guān)注。
[0004] 中藥指紋圖譜具有整體、宏觀、模糊分析等特點，可通過對中藥整體特征的描述， 采用適當(dāng)模糊處理方式，達到整體質(zhì)量控制的目的，因此成為中藥質(zhì)量控制的有效手段。其 中色譜指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學(xué)組分的整體特征可視化，從而披露出常規(guī)檢 驗難以發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題。雖然銀杏葉提取物的指紋圖譜還未被編入《中國藥典》，但銀杏葉 提取物中黃酮苷元本身的含量較低，如人為添加如槲皮素等黃酮苷元，則測得的總黃酮醇 苷含量結(jié)果明顯增高，表面上符合要求，實際影響藥品內(nèi)在質(zhì)量。為保證生產(chǎn)原料質(zhì)量穩(wěn) 定；為防止生產(chǎn)過程中摻假、摻雜現(xiàn)象；為保證不同批次原料藥一致性，本課題擬將銀杏酮 酯指紋圖譜與多成分含量測定相結(jié)合，提高現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種銀杏酮酯中黃酮類和 有機酸類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化條件的高效液相色譜方法首次建立 了銀杏酮酯中黃酮類和有機酸類成分的指紋圖譜，并且同時一次對銀杏酮酯中多種成分進 行定量分析。本發(fā)明中方法通過指紋圖譜和多成分含量測定可以比較全面的反映銀杏酮酯 中黃酮類和有機酸類成分的現(xiàn)狀，提高銀杏酮酯中黃酮類和有機酸類成分的質(zhì)控水平。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種銀杏酮酯中黃酮類和 有機酸類成分指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 1)供試品溶液的制備：稱取銀杏酮酯，加入甲醇水溶液，渦旋提取后，過濾，取續(xù) 濾液，即得供試品溶液；
[0008] 優(yōu)選地，所述銀杏酮酯加入的重量與所述甲醇水溶液加入的體積之比為1 : 80-120(g/ml)。
[0009] 更優(yōu)選地，所述銀杏酮酯加入的重量與所述甲醇水溶液加入的體積之比為1 : 100 (g/ml)〇
[0010] 所述銀杏酮酯和甲醇水溶液稱取時，應(yīng)當(dāng)精密稱取。
[0011] 優(yōu)選地，所述渦旋提取的條件為：提取時間：3-10min ;渦旋轉(zhuǎn)速：2500-3000r/ min〇
[0012] 更優(yōu)選地，所述渦旋提取的條件為：提取時間：5min ;渦旋轉(zhuǎn)速：2800r/min。
[0013] 所述渦旋提取是利用渦旋振蕩器對樣品進行的一種提取方式，通過偏心旋轉(zhuǎn)使試 管等容器中的溶劑產(chǎn)生渦流，從而使樣品與溶劑充分混合后提取樣品中所需成分，該提取 方法對于一些難溶解物質(zhì)也有較好溶解及提取效果。
[0014] 所述供試品溶液在密閉容器中進行渦旋提取，所述密閉容器為密閉的離心管或試 管。
[0015] 優(yōu)選地，所述過濾的方式為濾膜過濾方式。更優(yōu)選地，所述濾膜的孔徑為0. 45 μ m。
[0016] 2)參照品溶液的制備：稱取蘆丁對照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得參照 品溶液；
[0017] 優(yōu)選地，所述參照品溶液中蘆丁的CAS號為153-18-4。
[0018] 優(yōu)選地，所述參照品溶液中蘆丁的濃度為200-300 μ g/ml。更優(yōu)選地，所述參照品 溶液中蘆丁的濃度為250 μ g/ml。
[0019] 優(yōu)選地，步驟1)或步驟2)中，所述甲醇水溶液為10_90v/v%甲醇水溶液。
[0020] 更優(yōu)選地，所述甲醇水溶液為10-70v/v%甲醇水溶液。
[0021] 最優(yōu)選地，所述甲醇水溶液為60v/v%甲醇水溶液。
[0022] 3)測定：采用相同色譜條件的高效液相色譜（HPLC)法分別測定供試品溶液和參 照品溶液，將獲得的供試品溶液和參照品溶液的指紋譜圖，與銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖進 行比較，根據(jù)相對保留時間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中黃酮類和有機酸類 成分的指紋圖譜。
[0023] 優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：C18柱；柱溫：30-4(TC ;檢測 波長：230-280nm ;參比波長：400-500nm ;流速：0· 5-2. Oml/min ;進樣量：5-20 μ 1 ;流動相： 乙腈-0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液；分析 時間：70min ;梯度洗脫。
[0024] 更優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB C18 柱（150mmX4. 6mm，2. 7 μπι);柱溫：35°C ;檢測波長：254nm ;參比波長：450nm ;流速： lml/min ;進樣量：10 μ 1 ;流動相：乙腈-0. lv/v%磷酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為 0. lv/v%磷酸水溶液；分析時間：70min ;梯度洗脫。
[0025] 最優(yōu)選地，所述梯度洗脫的具體程序為：
[0026] O-lOmin，A 相：B 相體積比為 12 :88-13 :87 ;
[0027] 10-13min，A 相：B 相體積比為 13 :87-15 :85 ;
[0028] 13-20min，A 相：B 相體積比為 15 :85-16 :84 ;
[0029] 20-30min，A 相：B 相體積比為 16 :84-21 :79 ;
[0030] 30-40min，A 相：B 相體積比為 21 :79-23 :77 ;
[0031] 40-50min，A 相：B 相體積比為 23 :77-30 :70 ;
[0032] 50-70min，A 相：B 相體積比為 30 :70-75 :25。
[0033] 所述銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖是指按照國家食品藥品監(jiān)督管理局2000年8月15 日頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》中的規(guī)定，取同一種至少10個批 次的銀杏酮酯，分別按上述步驟1)和2)制備供試品溶液和參照品溶液，再按上述步驟3) 的HPLC條件進行測定后，分別獲得指紋圖譜，再將指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似 度評價軟件2. 0版》，生成對照圖譜，最終確定銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖。在實際檢測時，被 檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行相似度比較，當(dāng)相似度多〇. 9,即為合格，說明獲得被檢樣品中 銀杏酮酯的指紋全譜圖。
[0034] 優(yōu)選地，所述供試品溶液和參照品溶液的指紋譜圖與銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖進 行的比較時，采用國家藥典委員會發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2. 0版》進行 相似度比較，以參照品溶液的指紋譜圖中的蘆丁色譜峰（S峰）為參比峰，根據(jù)相對保留時 間，指認(rèn)出供試品溶液的指紋譜圖中其它共有特征峰。
[0035] 更優(yōu)選地，所述中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件的檢測條件為：時間窗：0. 15 ; 平均值法；多點校正；全譜峰匹配。
[0036] 優(yōu)選地，所述供試品溶液中黃酮類和有機酸類成分的指紋圖譜中的黃酮類和有機 酸類成分，采用電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS)法進行測定驗證。
[0037] 更優(yōu)選地，所述電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS)法的 檢測條件為：離子源：ESI源；檢測模式：負離子電噴霧電離模式（ESI );采集質(zhì)量范圍 (Mass range) :50_1200Da ;毛細管電壓（Capillary Voltage) :2. 5kV ;維孔電壓（Sampling Cone Voltage) :30V;離子源溫度（Soure Temperature) :110-130 °C，優(yōu)選為 120 °C ;去 溶劑化溫度（Desolvation Temperature) :450_550°C，優(yōu)選為500°C ;去溶劑化氣體流量 (Desolvation Gas Flow) :75〇-850L/hr，優(yōu)選為800L/hr;維孔氣體流量（Cone Gas Flow): 45_55L/hr，優(yōu)選為50L/hr ;校正液：甲酸鈉、亮氨酸腦啡肽（Leu_enkephaline，LE);碰撞氣 體：氬氣；低碰撞能量通道：5eV ;高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
[0038] 更優(yōu)選地，所述電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS)法，根據(jù) 供試品溶液中黃酮類和有機酸類成分的指紋圖譜中的共有特征峰，通過相對保留時間，確 定供試品溶液的指紋譜圖中黃酮類和有機酸類成分。
[0039] 所述電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜的檢測原理為：TOF-MS的質(zhì)量分析 器是一個離子漂移管。樣品在離子源中離子化后即被電場加速，由離子源產(chǎn)生的離子加速 后進入無場漂移管，并以恒定速度飛向離子接收器。離子以此速度穿過負極板上的柵條，飛 向檢測器。離子從負極板到達檢測器的飛行時間t，就是TOF-MS進行質(zhì)量分析的判據(jù)。
[0040] 更優(yōu)選地，所述電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS)法，可與 超高效液相色譜（UPLC)相結(jié)合，通過超高效液相色譜（UPLC)分別測定供試品溶液和參照 品溶液的指紋譜圖，將獲得的供試品溶液和參照品溶液的指紋譜圖，與銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指 紋譜圖進行比較，根據(jù)相對保留時間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中黃酮類和 有機酸類成分的指紋圖譜，再采用電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF-MS) 法測定供試品溶液中黃酮類和有機酸類成分的指紋圖譜中的共有特征峰，通過相對保留時 間，確定供試品溶液的指紋譜圖中黃酮類和有機酸類成分。
[0041] 最優(yōu)選地，所述超高效液相色譜法測定供試品溶液和參照品溶液指紋圖譜的色譜 條件，與上述高效液相色譜法相同。但是，超高效液相色譜法的色譜條件中，使用的流動相 為乙腈-0. 1-0. 4v/v%甲酸水溶液，優(yōu)選為乙腈-0. lv/v%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B 相為〇. 1-0. 4v/v%甲酸水溶液，優(yōu)選為0. lv/v%甲酸水溶液。
[0042] 由于電噴霧離子源