一種研究口炎清或其他中藥復(fù)方配伍關(guān)系篩選最優(yōu)組方的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種研究口炎清制劑或其他中藥方劑配 伍配伍關(guān)系，篩選最佳組方的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中醫(yī)治病注重辨證論治，方劑配伍則注重君臣佐使，通過多味中藥的相互配合來 實現(xiàn)對機體失衡狀態(tài)的修正。然而，由于東西方文化的差異，對于中藥復(fù)雜體系來說，傳統(tǒng) 的"君臣佐使"理論，尚未被西方醫(yī)學界接受。國內(nèi)外通過藥效實驗科學解釋中藥組方配伍 規(guī)律，尚處于發(fā)軔階段。用量化的指標來研究"君臣佐使"理論，是實現(xiàn)方劑學發(fā)展的必然 趨勢。賀豐等選取張仲景《傷寒論》明方麻黃湯（由麻黃、桂枝、杏仁、甘草四味藥材組成）， 以偽麻黃堿（PE)為指標，研究了不同配伍的麻黃湯給藥后人體內(nèi)PE的血藥濃度動態(tài)變化 過程，結(jié)果表明臣藥桂枝、佐藥杏仁、使藥甘草對PE藥代學參數(shù)具有顯著影響，且三者間存 在一定的交互作用，從而明確了麻黃湯方劑中臣佐使藥在方中的地位和作用。該組方規(guī)律 研究方法存在一些不足之處：（1)麻黃湯中方中麻黃的君藥地位缺乏研究數(shù)據(jù)支持，仍然 憑借經(jīng)驗確定；(2)只研究了麻黃中的單一效應(yīng)成分，不能完全代表其余三味藥材與麻黃 藥材間的相互作用；（3)無法具體闡述各味藥材對處方整體藥效貢獻的主次關(guān)系，以及各 味藥材各自藥效間的相互作用，科學篩選確證最佳組方配伍關(guān)系。
[0003] 口炎清顆粒由山銀花、玄參、麥冬、天冬、甘草5味藥材組成，可滋陰清熱、解毒消 月中，臨床用于治療陰虛火旺的口腔炎癥疾病，收錄在《國家基本藥物目錄》（2012年版），是 6個治療咽喉、口腔病的國家基本用藥之一。目前，基于藥效實驗研究口炎清顆粒的組方規(guī) 律，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本發(fā)明首次采用在體動物藥效與原料藥材含量相關(guān)聯(lián)的方法，明 確了 口炎清顆粒中各味藥材的藥效貢獻及其主次關(guān)系，揭示了其君臣佐使的組方規(guī)律，篩 選并確證了其原有組方配伍為最佳，為臨床用藥提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種研究復(fù)方中藥組方配伍 規(guī)律用于篩選確證最佳中藥配伍的方法，包括以下步驟：
[0005] (1)按復(fù)方中藥組方，以各組分的質(zhì)量百分含量為變量因素，采用均勻設(shè)計方法構(gòu) 建具有各組分不同投料比例的差異樣品；
[0006] (2)通過藥效學研究獲得各差異樣品的藥效數(shù)據(jù)；
[0007] (3)運用數(shù)理統(tǒng)計方法分析各差異樣品各組分含量與藥效間的關(guān)聯(lián)性，明確各組 分對藥效貢獻及其主次關(guān)系，從而確定其組方配伍規(guī)律，篩選最優(yōu)的配伍關(guān)系。
[0008] 該方法可于篩選和確證口炎清制劑抗炎藥效組方配伍關(guān)系的研究，具體包括以下 步驟：
[0009] (1)在口炎清制劑的組方配比的約束下，以各組分質(zhì)量百分含量為因素，采用均勻 設(shè)計方法構(gòu)建具有各組分不同投料比例，符合統(tǒng)計要求的若干差異樣品；
[0010] (2)構(gòu)建與口炎清制劑藥效對應(yīng)的體外炎癥模型，進行差異樣品藥效學實驗，檢測 其對促炎因子TNF- a、IL-8、IL-6和IL-I β的影響，獲得相關(guān)藥效數(shù)據(jù)；
[0011] (3)利用灰色關(guān)聯(lián)分析方法計算差異樣品組分含量與藥效間的關(guān)聯(lián)性，明確各組 分對藥效作用及其主次關(guān)系，篩選最優(yōu)的配伍關(guān)系。
[0012] 所述的差異樣品的制備方法為：按照《中華人民共和國藥典》2010年版口炎清顆 粒標準生產(chǎn)工藝制備成浸膏待用。
[0013] 所述的體外炎癥模型構(gòu)建方法為：用香煙提取物刺激人口腔黏膜角化細胞，構(gòu)建 急性口腔炎癥模型。
[0014] 所述香煙提取物的制備方法為：抽取適量充分燃燒的香煙煙霧，使其完全溶于 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用0. 22μπι濾膜過除菌，制備100%香煙煙霧提取物；所述構(gòu) 建急性口腔炎癥模型的具體方法為：將人口腔黏膜角化細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中孵育；用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成 單個細胞懸液，接種到孔板；培養(yǎng)24h，待細胞長至80 %密度時，以含對照標準品或供試品 的無胎牛血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘后用6%的香煙提取物刺激人口腔表皮 樣癌細胞造模，繼續(xù)孵育24小時，終止培養(yǎng)，用孔內(nèi)上清液進行檢測所述炎癥因子的水平。
[0015] 所述的檢測促炎癥因子的方法為Elisa試劑盒檢測法。
[0016] 由于山銀花組分與TNF- a、IL-8、IL-6和IL-I β 4個藥效指標間的關(guān)聯(lián)度顯著大 于其余組分，應(yīng)以山銀花發(fā)為君藥；由于組分玄參、天冬和麥冬與IL-6和IL-I β指標關(guān)聯(lián) 密切，與調(diào)節(jié)多種炎癥細胞的增殖、分化及迀移，以及促進白細胞迀移和黏附分子表達、弓丨 起炎癥介質(zhì)的釋放相關(guān)；甘草與TNF-α指標關(guān)聯(lián)密切，與誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細胞因子及炎 性介質(zhì)的產(chǎn)生、促進炎細胞向病變組織移行相關(guān)，確認組分玄參、天冬、麥冬和甘草通過相 互補充，起到增強山銀花藥效的作用。
[0017] 本發(fā)明基于口炎清顆粒原料藥材與抗炎藥效相關(guān)聯(lián)，科學解讀其組方中各味藥材 的作用及地位，闡明了其組方配伍規(guī)律，確證了其組方比例為最佳。本發(fā)明的方法可用于篩 選中藥最佳配伍，對指導(dǎo)其臨床用藥，提升其科學內(nèi)涵具有重要意義。本技術(shù)的實施應(yīng)用可 為其他復(fù)方中藥制劑的組方規(guī)律研究提供范例。
【附圖說明】
[0018] 圖1為口炎清顆粒各組分抗炎活性藥效作用及其主次關(guān)系的示意圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0020] 一、口炎清顆粒差異樣品的構(gòu)建及其藥效學研究
[0021] 1、實驗材料
[0022] I. 1實驗藥品與試劑
[0023] 口炎清差異樣品浸膏11批（批號：20140815)及口炎清浸膏（批號：20140515)，均 由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供；牛黃解毒片（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公 司制藥廠，批號：13121398);地塞米松（中國藥品生物制品檢定所，批號：100129-201105); 香煙（椰樹牌，廣東中煙工業(yè)有限公司）；MTT(Sigma，M2128-1G) ;TNF-a、IL-8、IL-6、 IL-I β Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone)。
[0024] 1. 2實驗儀器
[0025] 凈化工作臺：蘇州凈化安泰技術(shù)有限公司HT-840型；光學顯微鏡：Motic AE21 ; C02培養(yǎng)箱：F0RMA Seris 303792-6714型；超低溫冰箱：海爾BCD-568W ;十萬分之一電子 天平：Sartorius BP211D ;電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司130406887型；多 孔超微量核酸蛋白分析儀：Botek ;冷凍離心機：Eppendorf 5430R。
[0026] 2、實驗方法
[0027] 2.1差異樣品的構(gòu)建
[0028] (1)差異樣品的構(gòu)建
[0029] 根據(jù)口炎清顆粒的處方組成比例，山銀花：玄參：麥冬：天冬：甘草為 26:21:21:21:11，進行配方約束下五因素十一水平的均勻設(shè)計，，每一水平表示相應(yīng)藥材 占5味藥材總量的百分比，其中山銀花變化為16-36%，玄參0-42%，麥冬0-42%，天冬 0-42 %，甘草 0-22 %，見表 1-1。
[0030] 表1-1 口炎清顆粒差異樣品構(gòu)建方案
[0032] (2)差異樣品的制備
[0033] 基于差異樣品構(gòu)建方案表，委托廣州白云山和記黃埔中藥有限公司按照現(xiàn)有的口 炎清顆粒標準生產(chǎn)工藝制備差異樣品，各組浸膏的每味藥材重量見表1-2。
[0034] 表1-2 口炎清顆粒差異樣品浸膏的5味藥材重量
[0037] 2. 2差異樣品藥效學實驗
[0038] (1)細胞培養(yǎng)
[0039] HOK細胞（人口腔黏膜角化細胞），購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。培養(yǎng)于 1?^1-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素1001]/1^，鏈霉素10(^ 8/1^，？!17.2)，在 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中。
[0040] 消化細胞，MTT測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5 X IO4個/mL，并鋪96孔板， 每孔100 μ L ;ELISA測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為4 X IO5個/mL，并鋪24孔板，每孔 0. 5mL。細胞培養(yǎng)24h后，待密度至80%可給藥。
[0041] (2)香煙煙霧提取物的制備及各藥物的配制
[0042] 1)香煙煙霧提取物制備
[0043] 將2支燃燒的椰樹牌香煙煙霧用裝有IOmL的RPMI-1640培養(yǎng)基（無血清）的50mL 注射器連續(xù)抽吸6次，每次50mL，共300mL ;搖動使其充分溶解，經(jīng)0. 22 μ m微孔膜過濾后， 得到100 %濃度的CSE溶液，用RPMI-1640培養(yǎng)基（無血清）稀釋到需要的濃度后加入細 胞，使CSE終濃度為5%，30min內(nèi)用于實驗。
[0044] 2)藥物的配制
[0045] 各藥物用RPMI-1640培養(yǎng)基（無血清）配制，口炎清1-11號差異樣品終濃度 為55. 6 μ g/mL ;地塞米松（Dex)終濃度為1 μΜ ;牛黃解毒片（NP)終濃度為10 μ g/mL，經(jīng) 0. 22 μ m微孔膜過濾后使用。
[0046] (3)考察口炎清差異樣品的細胞毒性
[0047] 細胞鋪板如前所述，24h貼壁后除去培養(yǎng)基，加入200 μ L 口炎清差異樣品溶液，空 白對照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基（無血清），置于含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，按MTT方法進行測試。
[0048] (4)差異樣品藥效學實驗
[0049] 實驗分成15組：空白對照組，模型組（5 % CSE)，陽性對照Dex組（1 μ M)，陽性對 照NP組（10 μ g/mL)，和口炎清差異樣品1-11組（55. 6 μ g/mL)。
[0050] 細胞鋪板如前所述，24h貼壁后換成RPMI-1640培養(yǎng)基（無血清），繼續(xù)培養(yǎng)一晚 上；然后分別加入Dex、NP、口炎清差異樣品，空白對照組和模型組給予等量的無血清培養(yǎng) 基，于5% C02、37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，預(yù)保護Ih ;接著各組（除空白對照組外）加入終濃度為 5%的CSE，空白對照組給予等量的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24h ;最后取細胞上清液，并釆 用 ELISA 法檢測 TNF- a、IL-8、IL-6、IL-I β 含量。
[0051] (5)數(shù)據(jù)分析方法
[0052] 采用SPSS 19. 0軟件，運用單因素方差分析（ANOVA)和T檢驗方法進行分析，結(jié)果 均以7±S表示，P值小于0. 05或0.