檢測dera酶催化醛縮反應(yīng)液中氯乙醛含量及催化效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種酶催化效率的檢測方法，具體設(shè)及一種檢測DERA酶催化醒縮反 應(yīng)液中氯乙醒含量及催化效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是降血脂主要藥物，其結(jié)構(gòu)中均帶有側(cè)鏈（3R，5S)-二徑基醋結(jié)構(gòu)，該 結(jié)構(gòu)可作為甲徑戊二酸單酷輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，抑制HMG-CoA向甲徑戊酸的還 原性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低低密度脂蛋白膽固醇的水平，從而達(dá)到降低血脂的目的。
[0003] 他汀類藥物雖然化學(xué)結(jié)構(gòu)相對簡單，但其制備過程難度較大，原因有兩個(gè)，一是側(cè) 鏈（3R，5S)-二徑基醋具有2個(gè)手性中心難W通過一步反應(yīng)完成；二是側(cè)鏈（3R，5S)-二徑 基醋在他汀類分子中的對映體過量（e.e.)和非對映體過量（d.e.)值分別大于99. 5%和 99%，使得對映體的拆分比較困難。運(yùn)些因素都導(dǎo)致他汀類藥物側(cè)鏈合成產(chǎn)率較低，成本較 局。
[0004] 生物催化是解決當(dāng)前問題的重要途徑。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有生物酶對徑醒縮合反應(yīng) 有催化效果，其中醒縮酶DERA能夠催化乙醒和氯乙醒的連續(xù)醒縮反應(yīng)，生成帶有兩個(gè)手性 中屯、的6-氯-(3R，5S)-二徑基醒，在他汀類藥物合成中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 但不同的生物酶，甚至不同來源的DERA酶，對連續(xù)醒縮反應(yīng)的催化效果均不相 同。在尋找催化效果更佳的DERA酶的過程中，就需要對其產(chǎn)物進(jìn)行檢測，W評價(jià)DERA酶的 催化效率。然而，由于利用DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)時(shí)，對其產(chǎn)物的檢測非常困難，一般需 要用到氣相色譜等儀器，對儀器要求高，檢測成本高，從而嚴(yán)重限制了改進(jìn)DERA酶催化性 能的研究。
[0006] 通過檢測DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)的上清液中未反應(yīng)底物的含量，可W得出參 與催化反應(yīng)的底物的消耗量，從而可獲得DERA酶的催化效率。
[0007] 對于甲醒、乙醒等幾基化合物的檢測方法，一般是先將甲醒在酸性條件下與2， 4-二硝基苯阱反應(yīng)，生產(chǎn)穩(wěn)定的2,4-二硝基苯腺；然后可經(jīng)環(huán)己燒萃取，用配有電子波或 檢測器的氣相色譜儀測定2,4-二硝基苯腺的含量，得出甲醒的含量；還可將2,4-二硝基苯 腺置于堿性條件下生成有色的釀?lì)惢衔铮⒃?30皿左右波長下利用比色法測定釀?lì)惢?合物的吸光度，也可W計(jì)算出甲醒的含量。
[0008] 但DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)的反應(yīng)體系中，含有乙醒和氯乙醒兩種幾基化合物， 乙醒和氯乙醒均能依次與2,4-二硝基苯阱、堿液發(fā)生反應(yīng)，生成棟紅色化合物。在測量含 有兩種棟紅色化合物的樣本待測液的吸光度時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在430nm左右波長下測量 時(shí)，檢測結(jié)果極不穩(wěn)定，準(zhǔn)確率較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種檢測DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)液中氯乙醒含量的方法，該方 法具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、檢測靈敏度高等特點(diǎn)。
[0010] 一種檢測DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)液中氯乙醒含量的方法，包括W下步驟：
[0011] (1)取反應(yīng)上清液，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，獲得樣本反應(yīng) 液；
[0012] (2)向樣本反應(yīng)液中加入堿液繼續(xù)反應(yīng)，獲得樣本待測液； 陽01引 做在520~535nm波長下測量樣本待測液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)上清 液中氯乙醒的含量。
[0014] 傳統(tǒng)方法在檢測溶液中幾基化合物的含量時(shí)，一般是在430nm左右波長下測量樣 本待測液的吸光度。但本發(fā)明的上清液中含有乙醒和氯乙醒兩種幾基化合物，乙醒和氯乙 醒均能依次與2,4-二硝基苯阱、堿液發(fā)生反應(yīng)，生成棟紅色化合物。在測量含有兩種棟紅 色化合物的樣本待測液的吸光度時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在430nm左右波長下測量時(shí)，檢測結(jié)果極 不穩(wěn)定，準(zhǔn)確率較差。運(yùn)是因?yàn)橐倚褏⑴c反應(yīng)生成的棟紅色化合物A，其特異性吸收峰在 438nm處，而氯乙醒參與反應(yīng)生成的棟紅色化合物B，其特異性吸收峰卻在520~535nm，運(yùn) 是出乎本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)認(rèn)知之外的。同時(shí)棟紅色化合物B在430nm波長下也具有與棟 紅色化合物A相近的吸收峰，兩者的吸收峰彼此覆蓋，使得在430nm左右波長下測量樣本待 測液的吸光度時(shí)，測量結(jié)果不準(zhǔn)確。而本發(fā)明在520~535nm下測量樣本待測液的吸光度， 在該波長下只有棟紅色化合物B的吸收峰，測量結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確率和靈敏度均大大提高。
[0015] 具體地，所述方法包括：
[0016] (1)取反應(yīng)上清液，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，獲得樣本反應(yīng) 液；
[0017] 作為優(yōu)選，2,4-二硝基苯阱的終濃度為0. 0025 %~0. 005%，更為優(yōu)選的終濃度 為0. 005%。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)認(rèn)知，2,4-二硝基苯阱的加入量應(yīng)為過量，大于反 應(yīng)液中乙醒與氯乙醒的總量。
[0018] 作為優(yōu)選，上清液與2,4-二硝基苯阱的反應(yīng)時(shí)間為10~30min;更優(yōu)選的反應(yīng)時(shí) 間為20min。
[0019] (2)向樣本反應(yīng)液中加入堿液繼續(xù)反應(yīng)，獲得樣本待測液；
[0020] 作為優(yōu)選，加入堿液后至抑為8~9。 陽021] 作為優(yōu)選，樣本反應(yīng)液與堿液的反應(yīng)時(shí)間為5~20min;更優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間為 10min〇 陽02引 做在520~535nm波長下測量樣本待測液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)上清 液中氯乙醒的含量；
[0023] 作為優(yōu)選，在528nm波長下測量樣本待測液的吸光度，因棟紅色化合物B的最大吸 收峰在528nm處。
[0024] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法為：
[0025] (a)制備一組氯乙醒濃度呈梯度分布的標(biāo)準(zhǔn)品；
[00%] 化）取各標(biāo)準(zhǔn)品，加入2,4-二硝基苯阱，在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，再加入堿液繼續(xù) 反應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)品待測液；
[0027] (C)在520~535皿的波長下測量標(biāo)準(zhǔn)品待測液的吸光度；
[002引 （d)根據(jù)氯乙醒濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種快速檢測DERA酶催化效率的方法，包括W下步驟：
[0030] (1)在反應(yīng)體系中加入DERA酶、乙醒和氯乙醒，經(jīng)催化反應(yīng)后取上清液；
[0031] (2)利用上述的方法檢測上清液中氯乙醒的含量；
[0032] (3)計(jì)算得到DERA酶的催化效率K;
[0033] K= (A-B)/AX100%
[0034] A為反應(yīng)體系中氯乙醒的初始量，B為催化反應(yīng)后反應(yīng)體系中氯乙醒的量。
[0035] 本發(fā)明通過檢測上清液中未參與催化反應(yīng)的氯乙醒的含量，計(jì)算出氯乙醒參與催 化反應(yīng)的消耗量，通過反應(yīng)底物的消耗量來反映DERA酶的催化效率K。在相同的催化條件 下，氯乙醒的消耗量越大，說明該DERA酶的催化效率越高，反之，則說明DERA酶的催化效率 越低。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0037] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氯乙醒與乙醒等其他常規(guī)幾基化合物不同，氯乙醒依次與2,4-二硝 基苯阱、堿液發(fā)生反應(yīng)生成的棟紅色化合物B，其特異吸收峰在528nm處；在528nm下測量 樣本待測液的吸光度時(shí)，在該波長下只有棟紅色化合物B的吸收峰，不存在棟紅色化合物 A(乙醒依次與2,4-二硝基苯阱、堿液發(fā)生反應(yīng)生成）的干擾，測量結(jié)果穩(wěn)定、其準(zhǔn)確率和靈 敏度均大大提高。
【附圖說明】
[0038] 圖1為乙醒與2,4-二硝基苯阱衍生物的光譜掃描結(jié)果；
[0039] 圖2為氯乙醒與2,4-二硝基苯阱衍生物的光譜掃描結(jié)果； W40] 圖3為立種DERA酶催化連續(xù)醒縮反應(yīng)活性的定性檢測結(jié)果；
[0041] 圖4為氯乙醒濃度和528nm處吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 陽0創(chuàng) 1、溶液配制
[0044] (1)2,4-二硝基苯阱溶液（0. 1% ):取2,4-二硝基苯阱Ig，加乙醇1000血，使其 溶解，再緩緩加入鹽酸lOmU搖勻，即得。
[0045] (2)氨氧化鐘溶液（lOOg/L):取lOOg氨氧化鐘，加800血蒸饋水溶解，定容至1L， 即得。
[0046] 2、乙醒與2,4-二硝基苯阱衍生物特異性吸收峰的確定
[0047] 在24孔板的Ξ個(gè)孔中分別加入對照蒸饋水、0. 5mg/L乙醒溶液、Img/L乙醒溶液 各2血，加入100μL2,4-二硝基苯阱溶液，混