一種高硒真菌中硒形態(tài)測(cè)定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高砸真菌中砸形態(tài)的測(cè)定方法，屬于分析測(cè)試領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]砸是人體必需的微量元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的必需成分，砸有抗氧化的作用，與人體健康息息相關(guān)，砸具有抗癌、保護(hù)心臟、抗肝壞死、防治近視和白內(nèi)障、解毒、提高免疫力、延緩衰老和增強(qiáng)生殖功能等多種藥理作用。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)缺砸，而我國(guó)有72%的地區(qū)屬于缺砸地區(qū)，因此，尋找和開(kāi)發(fā)富砸產(chǎn)品，以保證人體攝入充足的砸，正被各國(guó)科學(xué)工作者關(guān)注。
[0003]真菌，是一種真核生物。最常見(jiàn)的真菌是各類蕈類，另外真菌也包括霉菌和酵母，真菌的細(xì)胞有含甲殼素(又叫幾丁質(zhì)、甲殼素、殼多糖)為主要成分的細(xì)胞壁，和植物的細(xì)胞壁主要是由纖維素組成的不同。目前，酵母、食用菌等真菌已開(kāi)始被應(yīng)用于砸營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化領(lǐng)域，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多富砸酵母、富砸食用菌等產(chǎn)品。研究表明，真菌對(duì)砸具有良好的富集效果，可被應(yīng)用于尚砸營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，制成尚砸廣品，應(yīng)用于砸添加領(lǐng)域。
[0004]目前，關(guān)于樣品中砸的測(cè)定主要分為總砸測(cè)定和形態(tài)測(cè)定，總砸測(cè)定用于評(píng)價(jià)反映樣品中總的砸的含量，目前已有較為完善可靠的科學(xué)測(cè)定方法。而關(guān)于砸形態(tài)測(cè)定方法，則研究的較少，而且砸在不同樣品中的結(jié)合形式不同，有的以蛋白結(jié)合態(tài)為主，有的則與多糖類結(jié)合，這樣就導(dǎo)致不同樣品的砸提取釋放方法不一，因而很難形成針對(duì)所有樣品的統(tǒng)一的處理測(cè)定方法。“富砸植物材料中砸形態(tài)的測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201110428248.4)、“富砸食用菌中砸形態(tài)的測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201110428249.9)等專利介紹了植物樣品和食用菌子實(shí)體中砸形態(tài)的處理測(cè)定方法，這些方法采用對(duì)樣品加入緩沖液或超聲破壁或酶法破壁，然后利用蛋白酶K和XIV進(jìn)行酶解，將樣品中各組分的砸溫和的釋放出來(lái)，然后利用高效液相色譜與原子熒光光譜法聯(lián)用(HPLC-HG-AFS)上機(jī)測(cè)定砸形態(tài)；“富砸大米中有機(jī)砸、蛋白砸、多糖砸或RNA砸含量測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201310135560.3)則將大米的各組分分別進(jìn)行提取，然后利用氫化物原子熒光法(AFS)測(cè)總砸的方法確定各組分的砸含量；“微波消解-1CP-MS法直接測(cè)定海產(chǎn)品中有機(jī)砸、蛋白砸或多糖砸的測(cè)定方法”(專利號(hào):ZL201210458397.1)則采用對(duì)樣品進(jìn)行提取分離，將含砸的各組分分離后，然后利用ICP-MS上機(jī)測(cè)定各組分總砸含量，從而確定樣品中的砸不同結(jié)合組分的含量；“一種富砸酵母中砸蛋氨酸的測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201110177717.X)首先將富砸酵母利用物理方法進(jìn)行破壁處理，然后利用酶及其他化學(xué)試劑對(duì)酵母中的砸蛋氨酸進(jìn)行分離提取，然后利用HPLC-FLD法測(cè)定富砸酵母中砸蛋氨酸的含量；“一種砸的測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201310658482.5)介紹了利用HPLC-HG-AFS測(cè)定砸形態(tài)的方法，該方法通過(guò)測(cè)定樣品中的總砸與無(wú)機(jī)砸含量，然后利用差減法得到樣品有機(jī)砸的含量。該方法僅簡(jiǎn)單的利用總砸與無(wú)機(jī)砸的差值確定為有機(jī)砸含量，不僅結(jié)果不精確，而且也無(wú)法確定具體的有機(jī)砸為何種形式的砸；“植物砸形態(tài)的測(cè)定方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201210215457.5)則首先將樣品利用酶進(jìn)行酶解，然后利用HPLC-1CP-MS上機(jī)測(cè)定各砸形態(tài)的含量；“從富砸酵母中提取含砸蛋白的方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?201110440135.6)則介紹了一種利用pH值11~14的堿溶液對(duì)富砸酵母中含砸蛋白的提取的方法，但該法利用的強(qiáng)堿類溶液會(huì)對(duì)砸形態(tài)造成破壞，不利于砸形態(tài)的測(cè)定。上述這些形態(tài)測(cè)定方法主要針對(duì)植物或水樣等易水解樣品，但利用這些方法對(duì)高砸真菌類樣品測(cè)定時(shí)，其提取率與檢出率均比較低，而且由于砸脅迫作用的存在，導(dǎo)致高砸真菌類樣品的細(xì)胞壁變厚，再加上細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與植物細(xì)胞壁的不同，故植物類樣品的砸形態(tài)測(cè)定方法不適用于高砸真菌類形態(tài)檢出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是要提供一種高砸真菌中砸形態(tài)的測(cè)定方法，旨在解決利用傳統(tǒng)測(cè)形態(tài)方法過(guò)程中砸的提取率不高的問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明提供的高砸真菌中砸形態(tài)測(cè)定的方法，包含以下步驟:
(1)樣品破壁處理:稱取高砸真菌樣品，加入弱堿性溶液進(jìn)行破壁處理，離心以去除堿溶液，并對(duì)沉淀部分進(jìn)行透析處理，去除樣品殘留的堿溶液；
(2)樣品球磨:稱取步驟(1)經(jīng)過(guò)弱堿性溶液破壁處理后的高砸真菌，加入緩沖液進(jìn)行球磨處理；
(3)樣品酶解:取步驟(2)球磨后的混合液，調(diào)節(jié)pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，進(jìn)行酶解；
(4)樣品分離后再酶解:將步驟(3)酶解后得到的混合物，離心分離，取離心后的上清液過(guò)0.22 μ m水系膜待測(cè)，將離心后的沉淀部分繼續(xù)加入緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，進(jìn)行酶解；
(5)樣品分離:將步驟(4)酶解后得到的混合物，進(jìn)行離心分離，取離心后的上清液過(guò)0.22 μ m水系膜待測(cè)；
(6)上機(jī)測(cè)定:對(duì)上述兩步驟中過(guò)膜后的酶解液采用高效液相色譜法與氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法聯(lián)用上機(jī)測(cè)定樣品中的砸形態(tài)(包括:四價(jià)砸(Se4+)、六價(jià)砸(Se6+)、砸代胱氨酸(SeCys2)、砸代蛋氨酸(SeMet)、砸甲基砸代胱氨酸(SeMeCys ))。
[0007]優(yōu)選地，步驟(1)所述弱堿性溶液為氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液，其濃度為0.01 ?0.05 mol/Lo
[0008]優(yōu)選地，步驟(1)所述高砸真菌樣品與所述弱堿性溶液的質(zhì)量比為1:5?1:10。
[0009]優(yōu)選地，步驟(1)中破壁處理的時(shí)間為10-20 min。
[0010]優(yōu)選地，步驟(2)所述樣品球磨時(shí)的緩沖液為pH值為7.5的0.05mol/L的PBS緩沖液或Tir-HCl緩沖液，所述經(jīng)過(guò)堿破壁處理后的高砸真菌與所述緩沖液的質(zhì)量比1:20?1:50ο
[0011]優(yōu)選地，步驟(2 )的球磨時(shí)間為2-4小時(shí)。
[0012]優(yōu)選地，步驟(3)中胃蛋白酶與步驟(2)球磨后的混合液的體積質(zhì)量比為20~50mg: 5-10 mL，37°C恒溫培養(yǎng) 18~24 h。
[0013]優(yōu)選地，步驟(4)中緩沖液與步驟(2)球磨后的混合液的質(zhì)量體積比為5~10 mL:5mL，胰蛋白酶與步驟(2)球磨后的混合液的體積質(zhì)量比為20~50 mg: 5-10 mL，37°C恒溫酶解18?24 ho
[0014]本發(fā)明中高砸真菌是指經(jīng)過(guò)液體深層富砸發(fā)酵培養(yǎng)得到的高砸真菌菌絲體，總砸含量在100 mg/kg (鮮重)以上。優(yōu)選為高砸酵母菌、高砸靈芝或高砸毛頭鬼傘。
[0015]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)經(jīng)過(guò)弱堿性溶液的破壁與球磨處理后，樣品的細(xì)胞壁被完全打開(kāi)，有助于細(xì)胞內(nèi)蛋白的釋放，利于后續(xù)的酶解過(guò)程；
(2)酶解時(shí)離心管采用水平放置的方式，加大了比表面積，有助于酶促反應(yīng)的發(fā)生；
(3)本發(fā)明中酶促反應(yīng)采用不同的酶對(duì)樣品進(jìn)行分步連續(xù)提取，排除不同酶之間的相互干擾，同時(shí)也將酶解后的酶解液與反應(yīng)體系分離開(kāi)，保證了酶解后樣品中各游離形態(tài)砸的穩(wěn)定性，同時(shí)也有利于下一步的酶促反應(yīng)。
[0016](4)采用本發(fā)明對(duì)高砸真菌樣品進(jìn)行測(cè)定，提取率達(dá)到50-80%，而采用傳統(tǒng)的植物樣品形態(tài)測(cè)定方法，直接利用蛋白酶K與蛋白酶XIV對(duì)樣品進(jìn)行酶解處理，其提取率不到20%，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，將提取率提高了近4倍。
[0017](5)本發(fā)明中各步驟反應(yīng)條件溫和，實(shí)驗(yàn)采用的弱堿、球磨處理等前處理過(guò)程、以及酶解等步驟均不會(huì)改變樣品體內(nèi)的砸形態(tài)，不會(huì)導(dǎo)致砸形態(tài)變化，更能真實(shí)的反映樣品內(nèi)砸形態(tài)的分布。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0019]實(shí)施例1:尚砸靈芝樣品砸形態(tài)測(cè)定實(shí)施例選用的高砸靈芝菌絲體總砸含量為209.8 mg/kg (ffff)o
[0020](1)高砸靈芝樣品的預(yù)處理:對(duì)液體深層富砸發(fā)酵培養(yǎng)得到的高砸靈芝樣品利用
18.2ΜΩ超純水進(jìn)行清洗，去除表面殘留的無(wú)機(jī)砸；
(2)樣品破壁處理:稱取10g靈芝鮮樣，加入50mL的0.01mol/L氫氧化鈉溶液，置于磁力攪拌器上攪拌20min。然后以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，去除堿溶液，取沉淀部分放入透析袋內(nèi)用超純水進(jìn)行透析處理，去除樣品殘留的氫氧化鈉；
(3)樣品球磨:稱取lg上述經(jīng)過(guò)堿破壁處理的樣品，加入50mlpH值為7.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行球磨處理，球磨頻率為30Hz，球磨時(shí)間為2h ；
(4)樣品酶解:取上述球磨后的樣品5ml于15ml離心管中，調(diào)節(jié)pH值至1.5-2.5，加入20 mg胃蛋白酶，然后將離心管水平放置于37°C恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)18-24h。
[0021](5)樣品分離后再酶解:將上述酶解后的樣品于冷凍高速離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為10000 rpm,離心時(shí)間15_30min，取離心后的上清液過(guò)0.22 μ m水系膜待測(cè)，將離心后的沉淀部分繼續(xù)加入5ml緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入20 mg胰蛋白酶，然后將離心管水平放置于37°C恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)18-24h。
[0022](6)樣品分離:將上述酶解后的樣品于冷凍高速離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為10000 rpm，離心時(shí)間15_30min，取離心后的上清液過(guò)0.22 μ m水系膜待測(cè)。
[0023](7)上機(jī)測(cè)定:對(duì)上述兩步驟中過(guò)膜后的酶解液采用高效液相色譜法與氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)聯(lián)用上機(jī)測(cè)定樣品中的砸形態(tài)。
[0024]實(shí)施效果:
經(jīng)過(guò)形態(tài)分析測(cè)定，靈芝樣品中形態(tài)以砸代甲硫氨酸(SeMet)和砸代半胱氨酸(SeCys)為主，形態(tài)提取率達(dá)到60%。
[0025]實(shí)施例2:尚砸靈芝樣品砸形態(tài)測(cè)定實(shí)施例選用的高砸靈芝菌絲體總砸含量為209.8 mg/kg (ffff)o
[0026](1)高砸靈芝樣品的預(yù)處理:對(duì)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)得到的高砸靈芝樣品利用18.2ΜΩ超純水進(jìn)行清洗，去除表面殘留的無(wú)機(jī)砸；
(2)樣品破壁處理:稱取10g靈芝鮮樣，加入100ml的0.05mol/L氫氧化鈉溶液，置于磁力攪拌器上攪拌20min。然后以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，去除堿溶液，取沉淀部分放入透析袋內(nèi)用超純水進(jìn)行透析處理，去除樣品殘留的氫氧化鈉；
(3)樣品球磨:稱取2g上述經(jīng)過(guò)堿破壁處理的樣品，加入40mlpH值為7.5的PBS緩沖液進(jìn)行球磨處理，球磨頻率為30Hz，球磨時(shí)間為2h ;
(4)樣品酶解:取上述球磨后的樣品5ml于15ml離心管中，調(diào)節(jié)pH值至1.5-2.5，加入50 mg胃蛋白酶，然后