納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清總IgE的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫分析領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清 總I姐的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE，I姐）是人體免疫球蛋白的一種，在正常人體 內(nèi)的含量很低，人體內(nèi)I姐含量的提高提示I型過(guò)敏的發(fā)生。過(guò)敏性疾病是指患者吸入、攝 入、食入或者注入含有致敏成分的物質(zhì)（過(guò)敏原）后觸發(fā)機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生特異性I姐抗體， I姐與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合從而使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同的過(guò)敏原再次刺激 機(jī)體，就可與I姐抗體結(jié)合從而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)及相關(guān)癥狀，如過(guò)敏性哮喘、枯草熱、等麻疹、 過(guò)敏性鼻炎、濕疹等I型過(guò)敏性疾病。I姐抗體介導(dǎo)的I型過(guò)敏反應(yīng)性疾病相當(dāng)普遍，世界 各國(guó)過(guò)敏反應(yīng)疾病的總發(fā)病率約為15%-30%，我國(guó)大約有5-10%的人受過(guò)敏的襲擾，是當(dāng)前 世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題，被世界衛(wèi)生組織（WHO)列為二十一世紀(jì)重點(diǎn)防治的Ξ大疾病之 一。因此，臨床上，總I姐檢測(cè)常作為過(guò)敏反應(yīng)性疾病的初篩試驗(yàn)。
[0003] 化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前發(fā)展最快、最先進(jìn)的免疫測(cè)定技術(shù)，其靈敏度和精確度 與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、巧光法高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。其W靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑 價(jià)格低廉、試劑穩(wěn)定、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)被廣大研究人員所認(rèn)可， 并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種納米磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清總I姐 的試劑盒及方法，研發(fā)和優(yōu)化了與血清學(xué)抗體反應(yīng)原理相關(guān)的各種關(guān)鍵技術(shù)，從而提高了 針對(duì)臨床患者體內(nèi)總I姐抗體的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，開(kāi)發(fā)出靈敏、穩(wěn)定的納米磁微?；?學(xué)發(fā)光診斷試劑。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種納米磁微粒化學(xué) 發(fā)光法定量檢測(cè)血清總I姐的試劑盒，包括的試劑有：生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液、 鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液、堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液、I姐校準(zhǔn) 品、I姐質(zhì)巧品。
[0006] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液的濃度為 0. 1~1.Oug/ml，所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液的濃度為0. 1~1.Omg/ml，所述堿 性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液的濃度為0. 1~2.Oug/ml。
[0007] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述I姐校準(zhǔn)品的濃度為：2IU/ml、10IU/ml、50IU/ ml、200IU/ml、1000IU/ml、5000lU/ml，所述I姐校準(zhǔn)品是I姐蛋白與0. 1M、抑值為7. 4 的Tris-肥1緩沖液配制得到的；所述I姐質(zhì)控品的濃度為：10lU/ml、200lU/ml，所述I姐 質(zhì)控品是I姐蛋白與0. 1M、抑值為7. 4的化is-HCl緩沖液配制得到的。
[0008] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液的制備過(guò)程 為：鼠抗人I姐抗體W1:20摩爾比加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，再用0.IM、抑值 為7. 4的憐酸鹽緩沖液透析得到。
[0009] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液的制備過(guò) 程為：將鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒用磁分離器沉淀，再用0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩 沖液重懸，混勻磁分離沉出，并重復(fù)清洗，清洗后的納米磁微粒分散于0. 1M、pH值為7. 4的 憐酸鹽緩沖液。
[0010] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液的制備 過(guò)程為：用0. 05M、抑值為6. 0的MES緩沖液對(duì)堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體稀釋。
[0011] 提供一種納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清總I姐的方法，包括步驟為： (1) 將待測(cè)血清樣本與生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒 共解育得到第一溶液. (2) 在外加磁場(chǎng)作用下，磁分離洗涂去除所述第一溶液中多余的生物素標(biāo)記的鼠抗人 I姐抗體得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐二抗并解育得到第Ξ溶液， 形成抗I姐抗體-I姐-抗I姐二抗的雙抗夾屯、結(jié)構(gòu)； (4) 在外加磁場(chǎng)作用下，磁分離洗涂去除所述第Ξ溶液中未結(jié)合的酶標(biāo)抗體和雜質(zhì)，得 到第四溶液； (5) 向所述第四溶液中加入酶促化學(xué)發(fā)光底物，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度； (6) 利用已知濃度的校準(zhǔn)品繪制發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)步驟（5)得到的發(fā)光強(qiáng)度對(duì)照 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出待測(cè)血清樣本中總I姐的含量。
[0012] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（1)和步驟（3)中所述的解育條件是在37°C下 反應(yīng)15-30分鐘；步驟（2)和步驟（4)中所述的磁分離操作為將溶液置于磁場(chǎng)中靜置2分 鐘，棄去上清后加入清洗液，之后重復(fù)此操作2次。 陽(yáng)013] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述定量檢測(cè)方法在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀Lumiray系 列上進(jìn)行，所述全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀Lumiray系列為L(zhǎng)umiray1200、Lumiray1220、Lumiray 1260 或Lumiray1280。
[0014] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述定量檢測(cè)方法包括的步驟為： (1) 將所述試劑盒放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀的試劑倉(cāng)里并進(jìn)行識(shí)別； (2) 將校準(zhǔn)品置于所述全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀的儀器樣本倉(cāng)，識(shí)別校準(zhǔn)品信息，分配校準(zhǔn)品 位置； (3) 將質(zhì)控物或待測(cè)樣本置于儀器樣本倉(cāng)，編輯檢測(cè)信息； (4) 啟動(dòng)運(yùn)行程序，所有校準(zhǔn)品/質(zhì)控物/待測(cè)樣本自動(dòng)進(jìn)行處理得到結(jié)果。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清總I姐的試劑盒 及方法，在化學(xué)發(fā)光免疫分析基礎(chǔ)上，通過(guò)引入具有高比表面積和磁分離作用的納米磁微 粒作為固相載體，從而提高抗體/抗原包被量的同時(shí)，簡(jiǎn)化了反應(yīng)過(guò)程中的清洗步驟，加快 了檢測(cè)的速度。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明實(shí)施例Ξ中I姐標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例四最低檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)中AB兩點(diǎn)濃度-發(fā)光值擬合曲線圖； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例四方法與化adia化iCAP系統(tǒng)測(cè)值結(jié)果比對(duì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。 陽(yáng)0化]實(shí)施例一： 提供一種納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清總I姐的試劑盒，包括如下試劑： (1) 生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液，濃度為0.化g/ml; (2)鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液，濃度為0. 4mg/ml ; (3) 堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液，濃度為0.化g/ml; (4% 個(gè)不同濃度水平的I姐校準(zhǔn)品：2IU/ml，10IU/ml，50IU/ml，200IU/ml，1000IU/ml，5000lU/ml; (5)2個(gè)濃度水平的1姐質(zhì)控品：10 111/1111，200 11]/1111。
[0019] 實(shí)施例二： 本發(fā)明提供的一種納米磁微粒全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清總I姐試劑盒的制備 包括如下步驟：血清總I姐試劑盒的制備： (1)配制緩沖液： 配制0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液，0. 1M、抑值為7. 4的Tris-肥1緩沖液，0. 05M、 抑值為6. 0的MES緩沖液。
[0020] 0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子 水，稱取2. 56g胞2冊(cè)〇4，12&0、0. 44g胞&口〇4,2&0和9g化C1，加入到燒杯中，攬拌使其充 分溶解，用肥1或化0H調(diào)節(jié)抑值至7. 4 + 0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的甘露醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1〇/〇的甘油，攬拌0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0021] 0. 1M、抑值為7. 4的Tris-HCl緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去 離子水，稱取12.llgTris(Ξ徑甲基氨基甲燒）加入到燒杯中，攬拌使其充分溶解，用肥1 或化0H調(diào)節(jié)抑值至7. 4 + 0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3%的Proclin 300,攬拌0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0022] 0. 05M、抑值為6.0的MES緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子水， 稱取9.76gMES(2-(N-嗎嘟代）乙橫酸)、9g化C1加入到燒杯中，攬拌使其充分溶液，用肥1 或化0H調(diào)節(jié)抑值至6.0+0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的Tween-20， 攬拌0.化至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0023] (2)制備生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液 將鼠抗人I姐抗體W1:20的比例加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，室溫條件下充 分混合反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)后的溶液用0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖液透析。BCA法測(cè)定 生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液的濃度，并調(diào)整其濃度到0.化g/ml。
[0024] (3)制備鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液 將鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒用磁分離器沉淀出來(lái)，用0. 1M、pH值為7. 4的憐酸鹽 緩沖液重懸，充分混勻15分鐘后磁分離沉出，棄去上清，再用0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩 沖液重懸，如此重復(fù)清洗5次，清洗后的納米磁微粒分散于0. 1M、抑值為7. 4的憐酸鹽緩沖 液，濃度為〇.4mg/ml。 陽(yáng)0巧](4)制備堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液； 用0. 05M、抑值為6. 0的MES緩沖液將堿性憐酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體稀釋到0.化g/mlο
[0026] (5)制備I姐校準(zhǔn)品 取I姐蛋白，用0. 1M、抑值為7.4的Tris-肥1緩沖液配制成2、10、50、200、1000、 5000IU/ml的校準(zhǔn)點(diǎn)。
[0027] (6)制備I姐質(zhì)控品； 取I姐蛋白，用0. 1M、抑值為7. 4的化is-肥1緩沖液配制成10、200IU/ml的質(zhì)控品。
[0028] (7)試劑盒組裝； 將生物素標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液、堿性憐 酸酶標(biāo)記的鼠抗人I姐抗體溶液、I姐校準(zhǔn)品和質(zhì)控品組裝成試劑盒。
[0029] 實(shí)施例S: 提供了一種納米磁微粒全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清總I姐試劑盒的檢測(cè)方法， 檢測(cè)在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀Lumiray系列化umiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260、 Lumiray1280等）上進(jìn)行，具體儀器操作步驟如下： (1)將試劑盒放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析/測(cè)定儀試劑