基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及結(jié)直腸癌細胞的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及基于量子點標記的結(jié) 直腸癌細胞的檢測方法。
[0002] 本發(fā)明還設(shè)及結(jié)直腸癌的檢測試劑盒技術(shù)，尤其是包含有單克隆抗體33. 26和單 克隆抗體31. 3的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 結(jié)直腸癌是世界上常見的Ξ大惡性腫瘤之一，其死亡率排第Ξ位，近年來，隨著人 們生活水平的提高W及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。但是，目前國內(nèi)外對 結(jié)直腸癌的早期診斷仍處于較低水平，約半數(shù)的患者明確診斷時已進入中期和晚期結(jié)直腸 癌。因此，提高結(jié)直腸癌的早期診斷是目前國內(nèi)外迫切需要解決的關(guān)鍵問題。目前早期診 斷結(jié)直腸癌有W下幾種的常用技術(shù)：
[0004] (1)大便隱血試驗是結(jié)腸癌常用的篩查方法，操作簡便、無創(chuàng)，主要缺點是靈敏度 低、特異性差。
[0005] (2)電子結(jié)腸鏡（簡稱內(nèi)鏡）是發(fā)現(xiàn)及診斷結(jié)直腸癌最有效的手段，也是目前早期 診斷結(jié)直腸癌的主要方法，尤其是在高危人群的檢查具有重要的臨床價值。因其為創(chuàng)傷性 檢查伴有出血、腸穿孔等危險的副作用、且需要一定的設(shè)備和儀器，對操作人員的專業(yè)水平 要求較高，故在大范圍人群的檢查存在著很大的局限性。
[0006] 做電化學發(fā)光技術(shù)檢測常用腫瘤標記物姻CEA、CA199、CA242、CA50,因其陽性 率低，缺乏特異性化6. 7% )，不合適用于結(jié)直腸癌的早期診斷。
[0007] (4)采用PCR技術(shù)檢測患者血清或糞便內(nèi)的DNA和檢測微小RNA的濃度對結(jié)直腸 癌治療監(jiān)測和預后評價有一定的價值，但它們在應用于結(jié)直腸癌的早期診斷方面還有待 于進一步研究。
[0008] 近年來，國內(nèi)外學者開始致力于尋找敏感、特異、可靠、有效的結(jié)直腸癌新生物標 記物W及建立無創(chuàng)傷性檢查和實驗方法來提高早期診斷結(jié)直腸癌的診斷率。
[0009] 近年來有研究顯示，M2型丙酬酸激酶（M2-PK)在胃腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和代謝中發(fā) 揮重要的作用。與正常組織相比，胃癌組織中M2-PK表達升高，與患者低生存率相關(guān)。國外 學者認為腫瘤M2-PK在血漿、糞便檢測其靈敏度巧0. 7% )和特異性巧6. 3% )較高，且與 疾病分期和淋己結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌新型腫瘤標記物，尤其是在糞便的檢測其 臨床價值更大。M2-PK主要W兩種形式存在，即前者主要存在于分化的組織和正常增殖的細 胞中，而后者常存在于腫瘤細胞中，與底物親和力低，促使腫瘤細胞內(nèi)糖代謝中間體如憐酸 締醇類物質(zhì)等積累，對腫瘤細胞的增殖具有重要作用。當腫瘤發(fā)生時往往伴隨二聚體形式 的Mz-PK含量增加。
[0010] 隨著技術(shù)的發(fā)展，量子概念也浸入了醫(yī)學領(lǐng)域。量子點如antumdots,QDs)又稱 半導體納米微晶體（Semicon化ctornanoCTystals)，是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的 一類半導體納米粒子。量子點具有一般納米微粒的基本性質(zhì)如表面效應、體積效應和量子 尺寸效應，具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、可忽略的光漂白等 優(yōu)越的巧光特性。正是基于量子點獨特的光學性質(zhì)使得它在生物化學、分子生物學、細胞生 物學、基因組學W及蛋白質(zhì)組學等研究中有著極大的應用前景。量子點納米標記巧光不僅 能特異性祀向腫瘤部位，還能通過巧光強弱反映出其活躍程度，可應用于腫瘤的早期診斷 和監(jiān)測療效。
[0011] 由于結(jié)直腸癌在遺傳學上是多步驟、多階段、多基因改變的過程，多基因聯(lián)合檢測 對提高檢出率及檢測敏感性更有重要意義。結(jié)直腸癌是一種多基因性疾病，在發(fā)生發(fā)展過 程中設(shè)及到相關(guān)基因的改變?nèi)纾篕-ras、APC等基因突變。國外學者報道K-ras基因突變與 結(jié)直腸癌密切相關(guān)，是結(jié)直腸癌的早期分子事件。APC基因突變與早期結(jié)直腸癌和腺瘤的診 斷有較大的臨床價值，尤其是在高危人群早期診斷具有重要意義。近年來我國學者提出富 含亮氨酸重復測序G蛋白禪聯(lián)受體5 (LGR5)，是一種干細胞分子標記物，也是Wnt信號通路 的祀基因之一，其表達量的增加能夠促進胃腸黏膜的自我更新，LGR5在結(jié)直腸癌組織中呈 高水平的表達。目前有研究提出AKT和PI3K基因突變可作為腫瘤的早期診斷、確定腫瘤的 浸潤范圍W及判斷預后的重要指標。近年來，有研究表明MXRAS有可能成為對大腸癌前病 變早期診斷的有實用價值的腫瘤標記物。
[0012] 因此急需一種能夠是實現(xiàn)與腫瘤細胞緊密結(jié)合的巧光探測技術(shù)，尤其是能夠利用 量子點技術(shù)，能夠準確實現(xiàn)對結(jié)直腸癌的檢測的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種能夠?qū)崿F(xiàn)對M2丙酬酸激酶進行準測 檢測的方法W及提供一種用于檢測結(jié)直腸癌細胞的試劑盒。
[0014] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提出的基本技術(shù)方案的一個方面為：一種基于 量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法，包括步驟：
[0015] A:制備抗人M2型丙酬酸激酶的單克隆抗體過程
[0016] 小鼠免疫：W基因重組M2型丙酬酸激酶蛋白為抗原結(jié)合等體積的弗氏完全佐劑 對第一小鼠和第二小鼠進行免疫；
[0017] 雜交瘤細胞株生成：取血清抗體效價達1X106W上的小鼠，無菌取小鼠脾臟制成 細胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株混合形成組合液，將聚乙二醇溶液加入所述組 合液，產(chǎn)生抗人M2型丙酬酸激酶的單克隆抗體的雜交瘤細胞并選取強陽性雜交瘤細胞進 行克隆化，獲得一株M2丙酬酸激酶33. 26的雜交瘤細胞株和一株M2丙酬酸激酶31. 1的雜 交瘤細胞株；
[0018] 單克隆抗體生成：在第一小鼠體內(nèi)接種M2丙酬酸激酶33. 26的雜交瘤細胞株制 備腹水獲得單克隆抗體33. 26,在第二小鼠體內(nèi)接種M2丙酬酸激酶31. 1的雜交瘤細胞株制 備腹水獲得得到單克隆抗體31. 3 ;
[0019] B:量子點巧光探針的制備過程
[0020] 對QD605溶液進行量子點活化；
[0021] 經(jīng)過量子點活化的QD 605的溶液與抗人M2型丙酬酸激酶的單克隆抗體通過非共 價偶聯(lián)形成量子點巧光探針；
[0022] C:往結(jié)直腸癌細胞加入量子點巧光探針，并在共聚焦巧光顯微鏡下觀察結(jié)直腸癌 細胞的巧光圖像或者通過計算機分析巧光圖像w判斷結(jié)果。
[0023] 本所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法中，所述基因重組M2型丙 酬酸激酶蛋白由攜帶M2丙酬酸激酶蛋白基因的大腸桿菌的工程菌株制配制而得。
[0024] 本所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法中，小鼠免疫過程中，所 述第一小鼠和第二小鼠為4-6周的雌性小鼠，對第一小鼠和第二小鼠進行第一次注射免 疫時，采用弗氏完全佐劑與等體積M2丙酬酸激酶抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點注射 30 后每10天W弗氏不完全佐劑與等體積M2丙酬酸激酶抗原混勻乳化后對第一小鼠 和第二小鼠進行注射免疫，一共注射免疫4次后，于融合前的3天，對第一小鼠和第二小鼠 的腹腔注射M2丙酬酸激酶抗原100 μ g進行加強免疫。
[00巧]本所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法中，單克隆抗體生成過程 中，腹水的制備是分別在第一小鼠和第二小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml弗氏不完全佐劑，使雜交 瘤細胞能W腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長；大約1~2周后，將2X1〇6個雜交瘤細胞懸浮于無 血清RPMI1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔內(nèi)制得。
[00%] 本所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法中，所述強陽性雜交瘤細胞 為陽性率達到100%的雜交瘤細胞。
[0027] 本發(fā)明的另一方面設(shè)計到一種試劑盒，包括包被捕獲抗體的微孔反應板、樣品處 理液、標記有標記物的檢測抗體、陽性對照、陰性對照和緩沖液，所述捕獲抗體為單克隆抗 體33. 26,所述的檢測抗體為單克隆抗體31. 3。
[0028] 本發(fā)明所述的試劑盒中，所述標記物為量子點、鏈霉親和素、膠體金和緩沖液中的 一種。
[0029] 本發(fā)明所述的試劑盒中，所述標記物為量子點和鏈霉親和素。
[0030] 本發(fā)明所述的試劑盒中，所述鏈霉親和素結(jié)合有生物素化抗體受體，該鏈霉親和 素與生物素化抗體的比例為1 : 40。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] 本發(fā)明所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法，所述單克隆抗體 33. 26和單克隆抗體31. 3,能特異性結(jié)合M2丙酬酸激酶蛋白的不同位點，可W實現(xiàn)準確、快 速地檢測出M2丙酬酸激酶含量，而與其它腫瘤如卵巢癌、前列腺癌和口腔癌無交叉反應， 能夠極大的提高結(jié)直腸癌的檢測準確度。更進一步地，由本發(fā)明所述的試劑盒通過單克 隆抗體33. 26和單克隆抗體31. 3所組成的試劑盒檢測M2丙酬酸激酶蛋白的靈敏度可達 30pg/ml，檢測M2丙酬酸激酶特異性抗原的靈敏度為6. 1P即/0. 1ml，而且快速、準確檢測及 能檢測分泌物包括糞便和血清。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明所述的基于量子點標記的結(jié)直腸癌細胞的檢測方法原理流程圖；
[0034] 圖2為本發(fā)明所述的M2丙酬酸激酶的蛋白濃度曲線圖；
[0035]圖3為本發(fā)明所述的免疫消暑的血清效價分析的曲線圖。
【具體實施方式】
[0036] W下將結(jié)合附圖1和附圖3對本發(fā)明做進一步的說明，但不應W此來限制本發(fā)明 的保護范圍。
[0037] 為了方便說明，將本發(fā)明設(shè)及的有關(guān)名詞做一下規(guī)定：
[0038] M2丙酬