運樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分 子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決運個問 題，我們將傳統(tǒng)的方法進行了改良，即： 1)因為能產(chǎn)生自身氨基連接的氨基實際很少，故省去了氨基的封閉過程。
[0051] 2)降低了辣根過氧化物酶：抗抗體的摩爾濃度比率至2 : 1，改良后的方法 比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。
[0052] 實施例2檢測辣椒中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建 組建檢測辣椒中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分： (1) 包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板； (2) 用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體； (3) 黃曲霉毒素B1單克隆抗體工作液； (4) 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0,0. 02,0. 05,0. 15,0. 60和1. 8μg/ L； (5) 底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脈，底物顯色液B液四甲 基聯(lián)苯胺； (6) 終止液為2mol/L鹽酸； (7) 濃縮洗涂液為抑值為7. 4、含有1. 0%吐溫-20、0. 4%。疊氮化鋼的0. 2mol/L的憐 酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積比。
[005引做濃縮復(fù)溶液為抑7. 6,含有4%酪蛋白，0. 15mol/L的憐酸鹽緩沖液，所述百分 比為重量體積比。
[0054]實施例3實際辣椒中黃曲霉毒素B1的檢測 樣品前處理 辣椒樣品粉碎后，過40目篩，稱取2.0 + 0. 05g樣品于100ml磨口Ξ角瓶中，加入10ml石油酸和50ml70%甲醇，加塞振蕩浸提lOmin，讓黃曲霉毒素溶解其中，分層后吸去上層 酸層，過濾除去辣椒粉，150化/min離屯、3min進一步去除辣椒粉和酸層，再取2ml上清液 和2ml去離子水進行1:1稀釋，在微量振蕩器上混勻Imin，取溶液50ul用于分析檢測。 [005引用試劑盒檢測 向包被有黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣 品溶液50μ1，隨機加入酶標(biāo)二抗50μ1，再加入黃曲霉毒素B1單克隆抗體工作液50μ1， 用蓋板模封板，37°c恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250μ1洗涂液，30s后倒 出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，最后用吸水紙除去殘余水分，每孔加入底物顯色液 A液過氧化脈，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺（TMB)，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色 15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μ1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處， 測定每孔吸光度值（OD值）。
[005引 3.檢測結(jié)果分析 用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值度）除W第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0標(biāo) 準(zhǔn)）的吸光度值度。）再乘W100%，得到百分吸光度值。W黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Υ軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液 的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出黃曲霉毒素Β1的殘留 量。
[0057] 實施例4試劑盒質(zhì)量的測定 1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗： 分別從Ξ個不同的時間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個試劑 盒，每板各抽出20個微孔，測定0. 15μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。
[005引 表2標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗（CV%)_
通過上述試驗結(jié)果可W得出，每批試劑盒各10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在3. 5% -7. 6%之 間，符合精密度小于或等于25 %的規(guī)定。
[0059] 2樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗 樣品精密度試驗： W0. 15μg/L濃度的黃曲霉毒素B1對辣椒進行測定，分別取Ξ個不同批次的試劑盒， 每個濃度重復(fù)5次進行測定，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表3。
[0060] 表3辣椒樣本可重復(fù)性試驗
結(jié)果表明辣椒樣本的變異系數(shù)均在8. 5% -10. 2%之間，符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 【2005】17號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中第四點精密度標(biāo)準(zhǔn)。
[0061]b)樣本準(zhǔn)確度試驗 取兩個濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為0. 05μg/kg、0. 15μg/kg，分別對樣品 進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，計算準(zhǔn)確度。
[0062] 表4試劑盒的準(zhǔn)確度
結(jié)果表明辣椒樣本添加回收率在80. 5% -87. 9%之間。符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 【2005】17號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)。
[0063] 3試劑盒保存實驗 試劑盒保存條件為2~8Γ，經(jīng)過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值（零標(biāo)準(zhǔn)）、 50%抑制濃度、黃曲霉毒素B1添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運輸和使用過 程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存條件下放置12天，進行加速老化實 驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放 入-20°C冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從W上結(jié)果可得出試劑 盒可W在2~8°C可W保存12個月W上。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測辣椒中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被原和酶標(biāo)記物，所述包 被原選自黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、黃曲霉毒素B1抗體和抗抗體；當(dāng)所述 包被原為黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng) 所述包被原為黃曲霉毒素B1抗體時，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；當(dāng) 所述包被原為抗抗體時，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物； 所述黃曲霉毒素B1半抗原是將黃曲霉毒素B1和鹽酸羥胺縮合反應(yīng)，再與琥珀酸酐通過縮 合反應(yīng)得到的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述黃曲霉毒素B1抗體為黃曲 霉毒素B1單克隆抗體，是以黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備得 到的；所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白常用載體蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為 辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠抗抗 體。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括黃曲霉 毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、終止液。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶 時，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色 液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1~2mol/L硫酸或鹽酸溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿 性磷酸酯酶時，顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為1~2mol/L氫氧化鈉溶液。7. -種檢測辣椒中黃曲霉毒素B1含量的方法，包括以下步驟； (1) 樣品前處理； (2) 用權(quán)利要求1-6任一項所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測； (3)檢測結(jié)果分析。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測辣椒中黃曲霉毒素B1藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒制備及檢測方法，它含有：包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，黃曲霉毒素B1特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液和濃縮復(fù)溶液。利用本發(fā)明所述試劑盒檢測黃曲霉毒素B1包括如下步驟：1）樣品前處理，2）試劑盒進行檢測，3）分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒用于辣椒中黃曲霉毒素B1的殘留量，具有操作簡便、費用低廉、靈敏度高、檢測時間短、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的特點。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN105277708
【申請?zhí)枴緾N201510123343
【發(fā)明人】何方洋, 羅貴昆, 謝體波, 馮才偉, 蒲小容, 石潔, 賈玲玲, 楊永菊
【申請人】貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年3月20日