一種單通道光學(xué)超分辨成像儀器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超分辨成像技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單通道光學(xué)超分辨成像儀器。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)今納米科技越來越成為自然科學(xué)技術(shù)發(fā)展的交叉前沿，如在納米水平上構(gòu)造新型電子學(xué)、新型光子學(xué)，在納米水平上合成新型表面催化劑，以及新型納米粒子廣泛用于生物(熒光)標(biāo)記等。而納米科技的發(fā)展離不開納米顯微成像技術(shù)，這方面以電子掃描顯微鏡和原子力顯微鏡為代表已成為許多實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)配置。然而研究納米尺度下的電子結(jié)構(gòu)、聲子態(tài)和等離激元等微觀內(nèi)部狀態(tài)方面，光學(xué)探測技術(shù)具有了強(qiáng)大的優(yōu)勢，但受光學(xué)衍射極限的限制，顯微分辨率很難提高。為了突破光學(xué)衍射極限的限制當(dāng)前研究者采用納米尺度探針和近場成像技術(shù)以及光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上的改進(jìn)不斷推進(jìn)空間分辨率，其中，像受激輻射倒空成像(STED)、隨機(jī)光學(xué)重建超分辨成像(STORM)和光激活定位超分辨成像方法(PALM)等這類新技術(shù)真正從概念上突破了光學(xué)衍射極限的限制使光學(xué)顯微進(jìn)入納米尺度，這類技術(shù)現(xiàn)統(tǒng)稱為納米鏡(Nanoscopy)技術(shù)。
[0003]納米鏡技術(shù)的基本原理為:基于單分子探測技術(shù)的隨機(jī)光學(xué)重建超分辨成像技術(shù)(STORM)，原理是基于單分子熒光的抑制，利用不同熒光標(biāo)記分子的不同波長或不同時(shí)間或不同強(qiáng)度的熒光激活，對生物樣品進(jìn)行多幀成像，依據(jù)可測定的熒光標(biāo)記之間的距離，最后重構(gòu)出超分辨的熒光像。
[0004]常規(guī)STORM采用Cy3和Cy5分子組成探針對，通過二者間的相互作用控制明暗兩態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，直至永久性漂白。具體過程如下:首先采用一束較強(qiáng)的紅光使觀測范圍內(nèi)所有的Cy5分子進(jìn)入暗態(tài)。接著采用較弱的綠光(?lw/cm2)抽運(yùn)Cy3分子到激發(fā)態(tài)，通過處于激發(fā)態(tài)的Cy3分子與Cy5分子的相互作用使一小部分Cy5分子從暗態(tài)恢復(fù)至熒光態(tài)。此時(shí)，再次利用紅光(?30w/cm2)可以激發(fā)這一小部分Cy5分子發(fā)射熒光。發(fā)射熒光后的Cy5分子將再次暫時(shí)進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定的暗態(tài)，等待下次被激活。通過紅綠激光對Cy3 —Cy5熒光分子進(jìn)行交替照明，可使Cy5熒光分子反復(fù)經(jīng)歷“激發(fā)一熒光發(fā)射一暫時(shí)漂白恢復(fù)一再激發(fā)”的循環(huán)達(dá)數(shù)百次，直到最終被永久性漂白。由此可見，Cy5分子單次循環(huán)類似于光激活定位超分辨成像(PALM)。將單次循環(huán)獲得的光子信號利用PSF數(shù)字化得到中心點(diǎn)。不同的是單次循環(huán)后Cy5分子只是暫時(shí)漂白。在Cy3分子的作用下可以恢復(fù)進(jìn)入下一次循環(huán)。多次循環(huán)得到多個(gè)中心點(diǎn)，最后將所有的中心點(diǎn)使用高斯函數(shù)擬合，以高斯函數(shù)中心點(diǎn)作為Cy5分子的位置。所有探針分子對都經(jīng)歷以上過程確定它們的位置，從而實(shí)現(xiàn)整幅圖像的重構(gòu)?，F(xiàn)有應(yīng)用ST0RM技術(shù)的超分辨成像儀器，如尼康N-ST0RM超分辨成像顯微鏡應(yīng)用3維高精度多通道分子定位和重建，從而實(shí)現(xiàn)了比傳統(tǒng)顯微鏡高10倍(橫向約20nm)的超高分辨率。但是，多通道激發(fā)機(jī)制給實(shí)驗(yàn)儀器造成了一定的復(fù)雜性，從而在一定程度上限制了 ST0RM超分辨成像儀器的應(yīng)用和推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種單通道光學(xué)超分辨成像儀器，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中超分辨成像(STORM)技術(shù)多通道激發(fā)的復(fù)雜性的問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種單通道光學(xué)超分辨成像儀器，所述單通道光學(xué)超分辨成像儀器至少包括激發(fā)光源模塊及成像、掃描與探測模塊；
[0007]所述激發(fā)光源模塊包括的激光器、聲光調(diào)制器、光纖耦合器；所述激光器、聲光調(diào)制器、及光纖耦合器依次排列；所述激光器、聲光調(diào)制器、頻率掃描及選擇裝置以及光纖耦合器的光軸在同一直線上；
[0008]所述成像、掃描與探測模塊包括兩片透鏡、偏振分束器、顯微物鏡、樣品臺及成像裝置；所述兩片透鏡、偏振分束器以及顯微物鏡的光軸在同一直線上，且所述成像裝置與偏振分束器的光軸在同一直線上。
[0009]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述激發(fā)光源模塊還包括頻率掃描及選擇裝置，所述激光器、聲光調(diào)制器、頻率掃描選擇裝置以及光纖耦合器的光軸在同一直線上。
[0010]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述頻率掃描及選擇裝置選自電控制帶通濾波片轉(zhuǎn)盤、電控制法布里-珀羅干涉濾波器及電控制角度可調(diào)非線性晶體中的一種或兩種以上組合。
[0011]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述頻率掃描及選擇裝置包括電控制帶通濾波片轉(zhuǎn)盤，所述電控制帶通濾波片轉(zhuǎn)盤設(shè)置于所述聲光調(diào)制器與所述光纖稱合器之間。
[0012]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述頻率掃描及選擇裝置包括電控制法布里-珀羅干涉濾波器，所述電控制法布里-珀羅干涉濾波器設(shè)置于所述聲光調(diào)制器與所述光纖耦合器之間。
[0013]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述頻率掃描及選擇裝置包括電控制角度可調(diào)非線性晶體，所述電控制角度可調(diào)非線性晶體設(shè)置于所述激光器內(nèi)部。
[0014]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述樣品臺為三維納米平移臺。
[0015]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述激發(fā)光源模塊及成像、掃描與探測模塊通過光纖連接。
[0016]作為本發(fā)明的單通道光學(xué)超分辨成像儀器的一種優(yōu)選方案，所述成像裝置為電子倍增電荷耦合器。
[0017]如上所述，本發(fā)明提供一種單通道光學(xué)超分辨成像儀器，所述單通道光學(xué)超分辨成像儀器至少包括激發(fā)光源模塊及成像、掃描與探測模塊；所述激發(fā)光源模塊包括的激光器、聲光調(diào)制器、光纖耦合器；所述激光器、聲光調(diào)制器、及光纖耦合器依次排列；所述激光器、聲光調(diào)制器、頻率掃描及選擇裝置以及光纖耦合器的光軸在同一直線上；所述成像、掃描與探測模塊包括兩片透鏡、偏振分束器、顯微物鏡、樣品臺及成像裝置；所述兩片透鏡、偏振分束器以及顯微物鏡的光軸在同一直線上，且所述成像裝置與偏振分束器的光軸在同一直線上。本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]1)本發(fā)明使用步進(jìn)電機(jī)作為驅(qū)動，實(shí)現(xiàn)電控制，并能獲得點(diǎn)反饋，易于實(shí)現(xiàn)對激發(fā)光源頻率掃描的精確控制。
[0019]2)本發(fā)明應(yīng)用頻率掃描技術(shù)對樣品進(jìn)行激發(fā)，實(shí)現(xiàn)了單通道激發(fā)，將大大簡化現(xiàn)有STORM超分辨成像儀器多通道激發(fā)的復(fù)雜性。
[0020]3)本發(fā)明采用三種不同的方式實(shí)現(xiàn)頻率掃描，便于根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求及觀察目的選用不同的頻率掃描方式增強(qiáng)了 STORM超分辨成像儀器的可用性和拓展性。
[0021]4)本發(fā)明采用偏振濾波技術(shù)進(jìn)行熒光收集，這在量子點(diǎn)共振激發(fā)單光子源中已經(jīng)證明是非常有效的手段，但用在STORM成像上還未見使用。
【附圖說明】
[0022]圖1顯示為本發(fā)明的超分辨成像裝置的正視示意圖。
[0023]圖2顯示為本發(fā)明的超分辨成像裝置的整體立體示意圖。
[0024]圖3顯示為本發(fā)明的采用電控制帶通濾波片