一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗nRNP/Sm抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗 nRNP/Sm抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1971年，Sharp在一組特殊的結(jié)締組織病患者血清中發(fā)現(xiàn)抗核糖核蛋白抗體表現(xiàn) 出高滴度，同時(shí)命名此結(jié)締組織病為混合性結(jié)締組織病。混合性結(jié)締組織病是一種同時(shí)或 不同時(shí)具有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病的綜合癥狀，患者主要 表現(xiàn)為雷諾現(xiàn)象、手指腫脹、皮疹、關(guān)節(jié)及肺部損害等病變。高滴度的抗nRNP/Sm抗體IgG 在混合性結(jié)締組織病患者中的檢出率可達(dá)95-100%，抗體滴度和疾病活動(dòng)度相關(guān)，被認(rèn)為 是重要的血清學(xué)標(biāo)志。
[0003] 目前臨床上抗nRNP/Sm抗體IgG的檢測(cè)有的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜 條免疫法應(yīng)用的是膜條顯色技術(shù)，其特點(diǎn)為固定幾個(gè)項(xiàng)目在同一膜條測(cè)定，一般通過手工 或者半自動(dòng)膜條儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最終通過肉眼進(jìn)行定性判定，該技術(shù)靈敏度低，反應(yīng)時(shí)間 長(zhǎng)，檢測(cè)項(xiàng)目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎(chǔ)上 有所提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復(fù)性差，反應(yīng)時(shí)間也較長(zhǎng)，仍然不能很好滿足臨 床的應(yīng)用。
[0004] 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，較以前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，在檢測(cè)靈 敏度、檢測(cè)范圍、檢測(cè)時(shí)間及自動(dòng)化操作上有了大大提高，且沒有污染，臨床應(yīng)用廣。目前， 使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析法在抗nRNP/Sm抗體IgG免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用仍未見。
[0005] 中國(guó)專利CN103105489A公開了檢測(cè)自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其 制備方法，涉及一種檢測(cè)多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無 用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品技術(shù)上的不足：在所述的硝酸纖維素膜 或尼龍膜上含有：分別由 dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2 共 10 種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測(cè)線，1條高濃度質(zhì)控帶，I 條中濃度質(zhì)控帶及1條低濃度質(zhì)控帶。該專利公開的是一種膜條免疫法，更能說明膜條免 疫法存在的靈敏度較低、線性范圍窄、重復(fù)性差和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗 nRNP/Sm抗體IgG的試劑盒，能夠低成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)抗nRNP/Sm抗體IgG準(zhǔn)確和 高精確地定量測(cè)定。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗 nRNP/Sm抗體IgG的試劑盒，所述試劑盒包括：Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品、Anti-nRNP/Sm IgG 試劑 1 號(hào)、Anti-nRNP/Sm IgG 試劑 2 號(hào)、Anti-nRNP/Sm IgG 磁分離試劑、Anti-nRNP/Sm IgG質(zhì)控品和清洗液。
[0008] 所述Ant i-nRNP/Sm I gG校準(zhǔn)品包括6個(gè)液體校準(zhǔn)瓶，所述液體校準(zhǔn)瓶?jī)?nèi)目標(biāo)濃度 分別為〇、5、20、50、100、200RU/mL的Anti-nRNP/Sm IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0009] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)為1個(gè)含有生物素標(biāo)記的nRNP/Sm抗原和牛血 清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0010] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)為1個(gè)含有堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗 體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0011] 所述Anti-nRNP/Sm IgG磁分離試劑為1個(gè)含有鏈霉親和素標(biāo)記的磁微粒和牛血 清白蛋白的Tr i s緩沖液瓶；
[0012] 所述Anti-nRNP/Sm IgG質(zhì)控品包括2個(gè)質(zhì)控瓶，所述質(zhì)控瓶?jī)?nèi)的濃度的范圍分別 為：16-24RU/mL和 80-120RU/mL。
[0013] 所述試劑盒檢測(cè)原理為將待測(cè)樣品、所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)混合溫育， 樣品中的抗nRNP/Sm抗體IgG與nRNP/Sm抗原特異性結(jié)合，再加入所述Anti-nRNP/Sm IgG 磁分離試劑，抗nRNP/Sm抗體IgG與nRNP/Sm抗原的免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面，洗滌 去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，加入Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)并混合溫育。堿性磷酸酶標(biāo)記 (ALP)的羊抗人I gG抗體與已經(jīng)結(jié)合在磁珠上的抗nRNP/Sm抗體I gG特異性結(jié)合。洗滌去除 未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后加入化學(xué)發(fā)光底物，ALP催化底物發(fā)光，測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（RLU)。 在一定范圍內(nèi)RLU與樣品中抗nRNP/Sm抗體IgG濃度呈正比，通過RLU就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線 上計(jì)算出待測(cè)樣品的抗nRNP/Sm抗體IgG含量。
[0014] 本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種抗nRNP/Sm抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量 檢測(cè)試劑盒的制備方法，所述試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0015] 步驟1.制備所述Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品包括：Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋 液配制步驟和Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品配制步驟：
[0016] 所述Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋液的配制步驟包括：
[0017] 加800mL純化水和11. 2g的Tris到容器中，攪拌混合均勻，再加8. 5g的氯化鈉和 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,加40g的牛血清白蛋白到容器 中，攪拌至完全溶解，再將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0.2 μπι濾器過濾， 將獲得的所述校準(zhǔn)品稀釋液保存在2-8°C待用；
[0018] 所述Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品的配制步驟包括：
[0019] 用上述Anti-nRNP/Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋液將抗nRNP/Sm抗體IgG分別配制為0、5、 20、50、100、200RU/mL 共 6 個(gè)濃度點(diǎn)；
[0020] 步驟2.制備所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)包括：Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào) 稀釋液配制步驟和Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)配制步驟：
[0021] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0022] 加800mL純化水、12. Ig的Tris和5. 8g的NaCl于IL容器中，攪拌至完全溶解， 再加入2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，攪拌至完全溶解， 將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得的所述試劑1號(hào) 稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0023] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑1號(hào)的配制步驟：
[0024] 用0· 2mol/L的ρΗ9· 0碳酸鹽緩沖液配制0· 5mg/mL的生物素溶液，按照nRNP/Sm抗 原與生物素溶液質(zhì)量比為10:1的比例在nRNP/Sm抗原溶液中加入到上述0. 5mg/mL的生物 素溶液，混合均勻，室溫靜置18h，反應(yīng)生成nRNP/Sm抗原-生物素連接物的反應(yīng)液，將得到 的nRNP/Sm抗原-生物素連接物反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的生物素， 得到nRNP/Sm抗原-生物素連接物，再用所述試劑1號(hào)稀釋液將nRNP/Sm抗原-生物素連 接物稀釋到〇. 1-0. 3 μ g/mL，得到所述的試劑1號(hào)；
[0025] 步驟3.制備所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)包括：Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào) 稀釋液配制步驟和Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0026] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0027] 加800mL純化水、6. 06g的4-羥乙基哌嗪乙磺和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完 全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1 g的ZnCl2、0. 2mL的Proclin 300和0.1 g的MgCl2， 攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 5-8. 0,用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得 的所述試劑2號(hào)稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0028] 所述Anti-nRNP/Sm IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0029] 將Img的羊抗人抗體和2-4 μ L的10mg/mL的偶聯(lián)劑為2-亞胺四氫噻吩溶液，室 溫靜置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽， 收集活化后抗體，將活化后的抗體保存在2-8°C備用，取I. 5mg的堿性磷酸酶，加入5mg/ mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液10-20 μ L，室溫靜置 30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，將活化后的堿性磷酸酶保存在2-8°C 備用，再將上述活化的羊抗人抗體與活化的堿性磷酸酶混合，在2-8°C條件下靜置12-24h， 用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得羊抗人抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，置于 2_8°C保存?zhèn)溆茫瑢⒀蚩谷丝贵w-堿性磷酸酶連接物濃溶液用所述試劑2號(hào)稀釋液稀釋到 0. 02-0. 1 μ g/mL，得到所述的試劑2號(hào)；
[0030] 步驟4.制備所述Anti-nRNP/Sm IgG磁分離試劑包括：Anti-nRNP/Sm IgG磁分離 試劑稀釋液配制步驟和Anti-nRNP/Sm IgG磁分離試劑配制步驟：
[0031] 所述Anti-nRNP/Sm IgG磁分離試劑稀釋液配制步驟：
[0032] 加800mL純化水、12. Ig的Tris和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完全溶解，再加 5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0. 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值 調(diào)為7. 9-8. 1，用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得的所述磁分離試劑稀釋液 保存在2-8 °C待用；
[0033] 所述Anti-nRNP/Sm IgG磁分離試劑配制步驟：
[0034] 取IOOmg磁微粒，磁分離去上清，取用0· 025mol/L的pH值為4. 5-6的2-嗎啉乙磺 酸緩沖液IOmL重懸，室溫下混勾2~3h，加入0. 5-1. OmL新配制的濃度為10mg/mL的碳二 亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺的嗎啉乙磺酸緩沖液，室溫振蕩混懸30-60min，使磁珠充分 活化，磁分離，去上清，用0. 〇25mol/L的pH值為4. 5-6的2-嗎啉乙