一種苯酞類化合物的液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，特別涉及一種苯酞類化合物的液-質(zhì)聯(lián)用 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 川芎和當(dāng)歸同為傘形科植物，分屬藁本屬和當(dāng)歸屬。苯酞類化合物，如洋川芎內(nèi)酯 I和H等是常用中藥川芎和當(dāng)歸的主要藥效成分，為傘形科植物的特征性成分之一。苯酞類 化合物對(duì)離體血液灌流的動(dòng)物有明顯的強(qiáng)心、擴(kuò)張血管、增加冠脈血流量和末梢血管的流 量等作用。洋川芎內(nèi)酯I等能明顯地抑制大鼠腦切片上谷氨酸遞質(zhì)的釋放，提示該類成分 有可能成為治療驚厥、中樞神經(jīng)損傷、中風(fēng)等疾病的藥物。此外，苯酞類化合物還對(duì)病原性 真菌有抑制作用，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，驅(qū)蟲(chóng)、收縮子宮平滑肌及抗腫瘤作用。
[0003] 在現(xiàn)有技術(shù)中，中藥及制劑中苯酞類化合物的定量分析方法研究常用高效液相色 譜法分離目標(biāo)化合物后在紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量，也有采用氣相色譜法對(duì)苯酞類化合物進(jìn)行 定性和定量分析。但由于氣相色譜不能分析在高溫下不穩(wěn)定的化合物，且有些樣品前處理 較復(fù)雜，所以限制了此方法在該類化合物定量分析中的應(yīng)用。
[0004] 近年來(lái)隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀以及飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等 也越來(lái)越多地應(yīng)用到天然藥物復(fù)雜體系中，成為中藥有效成分快速分離和鑒定的有力 手段。Chen L 等報(bào)道（Chen L，Qi J，Chang YX，Zhu D, Yu B (2009) Identification and determination of the major constituents in Traditional Chinese Medicinal formula Danggui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESI-MS/MS. J Pharm Biomed Anal.，50:127-137)苯酞類化合物的質(zhì)譜檢測(cè)也采用液-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)川芎藥材及其中藥 制劑中的有效成分進(jìn)行分離和鑒定。并且對(duì)該類化合物在動(dòng)物體內(nèi)的入血成分及代謝物進(jìn) 行篩查和鑒定也有所報(bào)道。另外，現(xiàn)有技術(shù)中也有采用UPLC-QT0F法對(duì)中藥制劑中的洋川 芎內(nèi)酯I等成分進(jìn)行定量分析。
[0005] 然而，針對(duì)復(fù)雜生物樣品中苯酞類化合物的定性、定量分析方法，目前的研究十分 有限，現(xiàn)有技術(shù)中采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法（HPLC-UV)，但其靈敏度有限。He C等 (He C, Wang S, Feng Y, Liang S, Lin X, Xu DS, Ruan KF(2012)Pharmacokinetics, tissue distribution and metabolism of senkyunolide I,a major bioactive component in Ligusticum chuanxiong Hort. (Umbelliferae). J Ethnopharmacol. , 142:706-713)也 采用HPLC-UV法測(cè)定SD大鼠靜脈或口服洋川芎內(nèi)酯I后體內(nèi)暴露情況，血漿中洋川芎 內(nèi)酯 I 的定量下限為 50ng/mL;Wang Y 等（Wang Y，Hong Y，F(xiàn)eng Y，Xu D，Liang S，Lin X，Shen L(2012)Comparative pharmacokinetics of senkyunolide I in a rat model of migraine versus normal controls. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. , 37:91-97) 報(bào)道了采用HPLC-UV法測(cè)定普通和偏頭痛大鼠血漿中洋川芎內(nèi)酯I的濃度，其定量下限也 為50ng/mL。這些研究中洋川芎內(nèi)酯I劑量范圍均較高：靜脈給藥約20mg/kg，灌胃給藥約 4_652mg/kg〇
[0006] 液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)也被應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品中苯酞類化合物的檢測(cè)中。杜思邈 等（杜思邈，李強(qiáng)，李秋芬，張忠亮，張寧（2013)芪麝丸中多效應(yīng)組分在大鼠體內(nèi)的組織分 布研究。中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，19:171-176)采用HPLC-MS/MS技術(shù)，檢測(cè)[M+H] +-特征性 子離子的離子傳輸通道，對(duì)大鼠灌胃給藥洋川芎內(nèi)酯I后不同組織中的洋川芎內(nèi)酯I進(jìn)行 定量分析，其定量下限為lOng/mL。但實(shí)際樣品中洋川芎內(nèi)酯I的濃度遠(yuǎn)高于定量下限，為 μ g/g級(jí)。高文娟等（高文娟，王雪，馬春靖，戴榮華，畢開(kāi)順，陳曉輝（2013)單方與復(fù)方給藥 后洋川芎內(nèi)酯I在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較研究。中國(guó)中藥雜志，38:427-431)采用HPLC-MS 法，檢測(cè)[M+Na]+的離子通道對(duì)洋川芎內(nèi)酯I進(jìn)行定量分析，其定量下限為6. 75ng/mL。
[0007] 由上可知，液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)由于其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)， 目前已廣泛應(yīng)用于藥物及其代謝物的高靈敏度定量分析中。然而，在采用液-質(zhì)聯(lián)用檢 測(cè)技術(shù)測(cè)定天然藥物以及復(fù)雜生物樣品中苯酞類化合物的過(guò)程中，該類化合物極易形成 [M+Na] +的準(zhǔn)分子離子峰，且不易打碎，無(wú)法形成特征性的子離子，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)高信噪比 的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。這一現(xiàn)象在不同實(shí)驗(yàn)室，采用不同廠家的質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均有發(fā)生。 由于鈉離子存在于自然界，包括分析實(shí)驗(yàn)室常用的玻璃流動(dòng)相瓶等均可能存在鈉離子的干 擾，因此檢測(cè)體系中鈉離子的濃度不易控制，導(dǎo)致分析結(jié)果產(chǎn)生波動(dòng)。本發(fā)明人在對(duì)苯酞類 化合物中洋川芎內(nèi)酯I及H的[M+H] +峰的離子化檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化后，其一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)有 明顯提高，但是二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)通道（[M+H]+峰一子離子通道）的噪音水平高，信/噪比非常 低，仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)高靈敏度的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。因此急需找到一種克服上述缺點(diǎn)的苯酞類化 合物的液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是在液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)苯酞類化合物的過(guò)程中，該類化合 物極易形成[M+Na] +的準(zhǔn)分子離子峰，且不易打碎，無(wú)法形成特征性的子離子；而[M+H] +峰 -子離子通道的噪音水平高，信/噪比非常低，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)高信噪比的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)的 問(wèn)題。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] -種苯酞類化合物的液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，在高效液相色譜儀的流動(dòng)相中加入含 鋰離子的有機(jī)化合物，使所述苯酞類化合物在電離后形成加鋰的準(zhǔn)分子離子峰，然后通過(guò) 檢測(cè)所述準(zhǔn)分子離子峰的[M+Li] +峰一子離子通道進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。
[0011] 本發(fā)明技術(shù)方案是通過(guò)在高效液相色譜儀的流動(dòng)相中加入一定量的含鋰離子的 有機(jī)化合物，使苯酞類化合物在電離后能夠形成加鋰的準(zhǔn)分子離子峰，繼而在給予一定能 量下能被打碎產(chǎn)生特征性的碎片離子，通過(guò)檢測(cè)[M+Li]+峰一子離子通道實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜檢 測(cè)。
[0012] 利用本發(fā)明方法，發(fā)明人對(duì)包括洋川芎內(nèi)酯I、H、N、A、正丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯在 內(nèi)的苯酞類化合物進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)這些化合物均可以形成[M+Li] +峰，從而能夠?qū)崿F(xiàn)高靈 敏度的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。
[0013] 本發(fā)明所述苯酞類化合物可以為川芎或當(dāng)歸中的主要活性成分。作為優(yōu)選，本發(fā) 明所述苯酞類化合物為洋川芎內(nèi)酯I、H和N。
[0014] 本發(fā)明所述苯酞類化合物采用本領(lǐng)域常規(guī)方法提取。
[0015] 在本發(fā)明中，發(fā)明人在高效液相色譜儀的流動(dòng)相中加入一定量的含鋰離子的有機(jī) 化合物，使所述苯酞類化合物在電離后形成加鋰的準(zhǔn)分子離子峰。由于鋰離子在實(shí)驗(yàn)條件 中罕見(jiàn)，因此可通過(guò)在流動(dòng)相中添加一定量的鋰離子實(shí)現(xiàn)對(duì)分析體系中鋰離子含量的控 制，減少分析結(jié)果的波動(dòng)。此外，通過(guò)加入鋰離子產(chǎn)生待測(cè)化合物的[M+Li] +峰還可以提高 一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)的選擇性。
[0016] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述含鋰離子的有機(jī)化合物為甲酸鋰或醋酸鋰。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明人研究了不同含鋰離子的有機(jī)化合物加入到流動(dòng) 相中的濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，加入到高效液相色譜儀流動(dòng)相中的含鋰離子的 有機(jī)化合物的終濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度極為重要。本發(fā)明所述含鋰離子的有機(jī)化合物的 在流動(dòng)相中的濃度為5~80 μ M，優(yōu)選為20~65 μ M，例如約50 μ M。
[0018] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明人研究了本發(fā)明方法對(duì)不同的目標(biāo)檢測(cè)物的靈 敏性。結(jié)果表明，本發(fā)明方法對(duì)苯酞類化合物，特別是洋川芎內(nèi)酯I、H和N具有更好的效 果。
[0019] 本發(fā)明方法可定量分析生物樣品或制劑樣品中的苯酞類化合物。作為優(yōu)選，所述 生物樣品為動(dòng)物或人使用含所述苯酞類化合物后的血漿、組織勻漿液或尿液。
[0020] 上述生物樣品可經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理。
[0021] 作為優(yōu)選，本發(fā)明測(cè)定人或動(dòng)物生物樣品中苯酞類化合物的方法具體為：向人或 動(dòng)物的生物樣品中加入甲醇（血漿：甲醇=1:3)進(jìn)行蛋白沉淀，離心后得到上清液；將所 述上清液在液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)儀中進(jìn)行分離和檢測(cè)。
[0022] 本發(fā)明中高效液相色譜系統(tǒng)可選擇本領(lǐng)域常規(guī)條件進(jìn)行設(shè)置。其中所選用的色譜 柱優(yōu)選為 Waters CORTECS UPLC C18色譜柱（50mm X 2. Imm ; 1. 6 μ m, Waters, USA)、Waters ΒΕ? Phenyl 色譜柱（50mmX 2. Imm ;1. 7 ym)等。
[0023] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述高效液相色譜系統(tǒng)的條件為：
[002