一種液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乳中激素的檢測(cè)方法，尤其適用于使用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中 己烯雌酚類激素。
【背景技術(shù)】
[0002] 己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮都屬于己烯雌酚類激素，是人工合成的非類 固醇同化性激素，曾被用在畜牧業(yè)養(yǎng)殖過程中，用來提高飼料轉(zhuǎn)化率及促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)。為了 防止這些激素隨畜產(chǎn)品進(jìn)入人體，危害人類健康；因此該類化合物的檢驗(yàn)方法成為解決這 一問題的前提條件。
[0003] 目前，檢測(cè)己烯雌酚類激素的方法有分光光度法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜法、高效液相色譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。近年來，由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 具有高靈敏度、高選擇性，在食品中農(nóng)藥殘留和獸藥殘留的檢測(cè)應(yīng)用越來越多。例如《GB/T 22992-2008牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量 的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》即使用了液質(zhì)聯(lián)用的方法，但其樣品前處理方法耗時(shí)較長(zhǎng)， 不利于企業(yè)日?？焖贆z測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法。
[0005] 本發(fā)明提供了一種液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法，樣品前處理 方法包括：稱取待測(cè)液態(tài)乳2g，加入3mL乙腈，渦旋混合20至40秒，然后在4000至5000r/ min下離心3至8min,移取上清液,得到上清液A ;向剩余沉淀中加入2mL乙腈,潤(rùn)旋混合20 至40秒，然后在4000至5000r/min下離心3至8min，移取上清液，得到上清液B ;合并上清 液A和上清液B，再加入5mL水混合均勻，最后用0. 1至0. 2mol/L的NaOH調(diào)pH值至10. 9 至11. 1，得到提取液；以及將提取液經(jīng)固相萃取柱凈化，得到待測(cè)液。
[0006] 本發(fā)明中的液態(tài)乳可以是生乳，例如生牛乳，還可以是奶粉加水溶解后制得的復(fù) 原乳，還可以是各種液態(tài)乳制品，例如調(diào)制乳。
[0007] 在液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法的一種示意性實(shí)施方式中，固 相萃取柱凈化的方法為：取MAX固相萃取柱，依次用3至5mL甲醇和3至5mL水活化和平 衡；取提取液使其經(jīng)過MAX固相萃取柱，控制流速0. 5至lmL/min ;用3至5mL淋洗液洗滌 MX固相萃取柱，棄去全部流出液；用3至5mL洗脫液洗脫MX固相萃取柱，并收集洗脫液； 以及將收集到的洗脫液在40°C水浴下氮?dú)獯蹈?，加入定容液渦旋溶解，最后過0. 22 μ m有 機(jī)系濾膜，得到待測(cè)液。
[0008] 在液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法的一種示意性實(shí)施方式中，淋 洗液為取5mL甲醇并用水定容至IOOmL制得；洗脫液為取5mL甲酸并用甲醇定容至IOOmL 制得；定容液為取50mL乙腈并用水定容至IOOmL制得。
[0009] 在液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法的一種示意性實(shí)施方式中， 液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)時(shí)的色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱，規(guī)格為2. IX 100mm、 1. 8 μ m ;柱溫:4(TC ;進(jìn)樣體積：10 μ L ;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；流速:0· 35mL/min ; 梯度洗脫：〇至3. 0 min, 50%流動(dòng)相A至80%流動(dòng)相A ;3. 0至4. 0 min, 80%流動(dòng)相A至100% 流動(dòng)相A ;4. 0至5. 0 min, 100%流動(dòng)相A至50%流動(dòng)相A。
[0010] 在液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法的一種示意性實(shí)施方式中，液 質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)時(shí)的質(zhì)譜條件為：離子化模式：電噴霧負(fù)離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān) 測(cè)；電離電壓：3. 00 kv ;離子源溫度：110°C ;去溶劑氣溫度：350°C ;去溶劑氣-氮?dú)饬髁浚? 600 L/h ;碰撞氣-高純Ar流量：50 L/h。
[0011] 本發(fā)明提供的一種液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚類激素的方法，其操作簡(jiǎn)單 快速，且檢測(cè)準(zhǔn)確性和回收率均能滿足檢測(cè)要求。與《GB/T 22992-2008牛奶和奶粉中玉米 赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》 中的方法相比，本發(fā)明方法在乙腈提取后無需將合并后的上清液氮?dú)獯蹈桑瑴p少操作步驟， 縮短樣品前處理時(shí)間，且與《GB/T 22992-2008》具有相當(dāng)?shù)臋z測(cè)準(zhǔn)確性和回收率。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例說明 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0013] 實(shí)施例1
[0014] 1、實(shí)驗(yàn)儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI) (TQD美國Waters)和 固相萃取裝置(美國Supelco)。
[0015] 2、實(shí)驗(yàn)試劑與材料 己烯雌酸、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）； 甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純； 實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)超純水； MAX固相萃取柱（60mg/3ml，美國waters公司）。
[0016] 3、溶液的配制。
[0017] (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取適量的己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成l〇〇mg/L的 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18°C冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí)，根據(jù)需要用50%乙腈水溶液稀釋成0. 002 μ g/mL、 0· 005 μ g/mL、0. 01 μ g/mL、0. 02 μ g/mL、0. 05 μ g/mL、0. 10 μ g/mL 的六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工 作液。
[0018] (2)樣品提取液 淋洗液：取5ml甲醇，用水定容至100mL ; 洗脫液：取5ml甲酸，用甲醇定容至100mL ; 定容液：取50ml乙腈，用水定容至100ml。
[0019] 4、色譜條件 色譜柱4〔〇1]幾￥皿^：批3 13柱（2.1\10〇111111，1.8以111);柱溫：4〇1：;進(jìn)樣體積 ：1(^1^ 流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫：0~3. 0 min, 50%A~80%A ;3. 0~4. 0 min, 80%A ~100%Α ;4· O ~5· O min，100%A ~50%A。流速：0· 35ml/min。
[0020] 5、質(zhì)譜條件 離子化模式：電噴霧負(fù)離子模式（ES-); 質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM); 電離電壓（kv) :3. 00 ; 離子源溫度（°C) :110 ; 去溶劑氣溫度（°C) :350 ; 去溶劑氣（N2)流量（L/h) :600 ; 碰撞氣（高純Ar)流量（L/h) :50 ; 錐孔電壓、碰撞能量及定性和定量離子等質(zhì)譜參數(shù)見表1。
[0021] 表1己烯雌酚類激素的質(zhì)譜參數(shù)
注：*為定量離子。
[0022] 6、樣品前處理 a、 稱取待測(cè)液態(tài)乳2g，加入3mL乙腈，潤(rùn)旋混合20秒，然后在4000 r/min下離心3 min, 移取上清液，得到上清液A ; b、 向剩余沉淀中加入2mL乙腈，潤(rùn)旋混合20秒，然后在4000 r/min下離心3 min,移取 上清液，得到上清液B ; c、 合并上清液A和上清液B，再加入5mL水混合均勻，最后用0. 15mol/L的NaOH調(diào)pH 值至10. 9,得到提取液； d、 凈化：取MX固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3mL水活化和平衡；取步驟c中得到的 提取液，使其經(jīng)過MAX固相萃取柱，控制流速〇. 5-lmL/min ;用3mL淋洗液洗滌MAX固相萃 取柱，棄去全部流出液；用3mL洗脫液洗脫MAX固相萃取柱，并收集洗脫液；將收集到的洗 脫液在40°C水浴下氮?dú)獯蹈桑尤隝 mL定容液渦旋溶解，最后過0. 22 μ m有機(jī)系濾膜，得到 待測(cè)液。
[0023] 7、檢測(cè) 用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀對(duì)制備得到的標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出待測(cè)液態(tài)乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的濃度。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，僅將樣品前處理方法替換如下，其余方法設(shè)計(jì)同實(shí)施例1。
[0026] 樣品前處理方法： a、 稱取待測(cè)液態(tài)乳2g，加入3mL乙腈，潤(rùn)旋混合30秒，然后在5000r/min下離心5min， 移取上清液，得到上清液A ; b、 向剩余沉淀中加入2mL乙腈，潤(rùn)旋混合30秒，然后在5000r/min下離心5min，移取上 清液，得到上清液B ; c、 合并上清液A和上清液B，再加入5mL水混合均勻，最后用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH 值至11，得到提取液； d、凈化：取MX固相萃取柱，依次用4mL甲醇和4mL水活化和平衡；取步驟c中得到的