一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)磁性微球的抗體熒光標(biāo)記新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)磁性微球的抗體熒光標(biāo)記新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對健康的日益關(guān)注和醫(yī)療改革的深化，國內(nèi)體外診斷市場蓬勃發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年體外診斷市場的規(guī)模超過167億元，2013年為215億元，并仍將以15?20%的速度繼續(xù)增長。體外診斷的重要途徑之一是采用標(biāo)記抗體特異性地顯示抗體與目標(biāo)分子之間的相互作用或通過放大效應(yīng)提高檢測靈敏度。目前標(biāo)記抗體的制備主要采用液相法(http://www.drmr.com/abcon/，2004)，存在對抗體的純度和濃度要求高、標(biāo)記反應(yīng)的偶聯(lián)程度不易控制、過程冗長和抗體活性易受影響等缺點(diǎn)。近年來，抗體固相標(biāo)記法成為研究熱點(diǎn)(Journal of Molecular Recognit1n，2004，17:268 ;Proteomics，2014，14:14)，該方法可以較好地克服液相法存在的缺點(diǎn)，標(biāo)記的同時(shí)兼具對抗體純化和濃縮的作用，因此具有良好的應(yīng)用潛力。
[0003]固相標(biāo)記材料的性能很大程度上取決于偶聯(lián)在材料表面的功能配基，功能配基決定了固相材料對抗體的吸附和解吸性能。目前，文獻(xiàn)已報(bào)道的配基包括金屬螯合配基和蛋白 A 親和配基(Journal of Molecular Recognit1n，2004，17:268 ；Journal ofImmunological Methods，2007，22:1)。其中金屬螯合配基對抗體的選擇性較差，對抗體的純度要求較高；而蛋白A親和配基雖然對抗體具有高度的特異性，但價(jià)格昂貴、抗體的吸附容量低，同時(shí)洗脫條件過酸易導(dǎo)致抗體活性損失(Journal of Chromatography A, 2014,1355:12)。疏水性電荷誘導(dǎo)層析(Hydrophobic charge induct1n chromatography,HCIC)是近年來發(fā)展起來的抗體分離新方法。HCIC功能配基包含疏水和荷電基團(tuán)，在中性條件下，利用疏水相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白的吸附，且具有耐鹽吸附的特性；隨后通過調(diào)節(jié)溶液PH，引入靜電排斥力協(xié)助解吸，可有效避免因親和力過高而導(dǎo)致的洗脫困難，實(shí)現(xiàn)快速洗脫(Molecular Simulat1n，2010，36:1096 ;B1technology Progress，2010，26:134)。因此，采用HCIC配基不僅能實(shí)現(xiàn)抗體固相標(biāo)記中的選擇性吸附，又能在完成標(biāo)記后高效回收抗體，降低固相標(biāo)記過程對抗體純度和濃度的要求，并較好地保存抗體的活性。
[0004]目前抗體固相標(biāo)記的操作過程復(fù)雜，涉及固相與抗體的混合、抗體與游離標(biāo)記分子的混合以及標(biāo)記分子和固相的分離等步驟，如何簡化過程，實(shí)現(xiàn)高效的抗體標(biāo)記工藝，是固相標(biāo)記方法推廣亟需解決的問題。磁分離技術(shù)可以從復(fù)雜的料液中簡便快速地分離目標(biāo)物，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的分離、富集、回收和再利用。磁分離技術(shù)中常用的材料是磁性瓊脂糖復(fù)合微球，該材料不僅具有優(yōu)良的磁響應(yīng)性，同時(shí)瓊脂糖組分親水性好、生物相容性非特異性吸附低，同時(shí)表面富含羥基，可以方便的進(jìn)行功能配基的偶聯(lián)。借助磁性復(fù)合微球在外加磁場作用下的磁性導(dǎo)向效應(yīng)，促使微球快速分散和富集，有利于簡化固相標(biāo)記的操作過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體熒光標(biāo)記新方法。所述的一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體熒光標(biāo)記新方法，其特征在于包括如下步驟:
[0006]1)取適量待標(biāo)記的抗體溶于由生理鹽水和0.5M pH 7-9的碳酸鈉緩沖液(9: 1)構(gòu)成的孵育緩沖液中，與具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育0.5-8小時(shí)；
[0007]2)測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計(jì)算抗體吸附量，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；
[0008]3)根據(jù)計(jì)算的抗體吸附量，按照每毫克抗體加入0.01-20mg的異硫氰酸熒光素，將異硫氰酸熒光素緩慢添加至裝有磁性微球的三角瓶中，4°C下振蕩混合1-8小時(shí)，進(jìn)行熒光標(biāo)記；
[0009]4)標(biāo)記完成后，在外加磁場的輔助下，用孵育緩沖液洗滌3次，除去游離的異硫氰酸熒光素；
[0010]5)采用1M醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.0-5.5，4°C下振蕩混合5_30分鐘，回收標(biāo)記抗體。
[0011]所述的一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體熒光標(biāo)記新方法，其特征在于所述的具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的磁性微球?yàn)榕悸?lián)有4-巰乙基吡啶或氨基咪唑的磁性瓊脂糖微球。
[0012]所述的一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體熒光標(biāo)記新方法，其特征在于所述的孵育緩沖液為生理鹽水和0.5M pH 7-9的碳酸鈉緩沖液按照質(zhì)量比9: 1的比例混合的緩沖液。
[0013]所述的一種基于疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體熒光標(biāo)記新方法，其特征在于所述的洗脫pH值為4.0-5.5。
[0014]本發(fā)明采用具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的磁性瓊脂糖微球進(jìn)行抗體的熒光標(biāo)記，充分發(fā)揮了疏水性電荷誘導(dǎo)微球的抗體吸附容量大、耐鹽吸附以及洗脫溫和便利等優(yōu)點(diǎn)，并結(jié)合磁性響應(yīng)特點(diǎn)使得微球可以通過外加磁場的施加來實(shí)現(xiàn)微球與料液的快速分離，尤其在料液中含有細(xì)胞或其他固體雜質(zhì)時(shí)。因此，采用具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的磁性微球進(jìn)行抗體熒光固相標(biāo)記，可以降低對抗體濃度和純度的要求，擴(kuò)大抗體標(biāo)記的范圍，減少透析和凝膠過濾等步驟，極大地提高抗體熒光標(biāo)記的效率。此外，微球的性質(zhì)穩(wěn)定，配基牢固，清洗再生方便。
【附圖說明】
[0015]附圖是采用本發(fā)明的方法吸附有熒光染料標(biāo)記蛋白的介質(zhì)微球的激光共聚焦顯微圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述:
[0017]實(shí)施例1
[0018]取50mg待標(biāo)記的抗體溶于50mL孵育緩沖液(生理鹽水和0.5M pH 7的碳酸鈉緩沖液的體積比為9: 1)，配制抗體溶液，與l.0g偶聯(lián)有4-巰乙基吡啶的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育0.5小時(shí)；測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計(jì)算抗體吸附量為45mg/g，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；加入
0.45mg異硫氰酸熒光素，4°C下振蕩混合8小時(shí)，進(jìn)行熒光標(biāo)記；標(biāo)記完成后，在外加磁場的輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，除去游離的異硫氰酸熒光素；采用1M醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4，4°C下振蕩混合5分鐘，回收標(biāo)記抗體。
[0019]實(shí)施例2
[0020]取50mg待標(biāo)記的抗體溶于50mL孵育緩沖液(生理鹽水和0.5M pH 8的碳酸鈉緩沖液的體積比為9: 1)，配制抗體溶液，與l.0g偶聯(lián)有4-巰乙基吡啶的磁性微球振蕩混合，4°C下，孵育1小時(shí)；測定吸附前后溶液中抗體的濃度，計(jì)算抗體吸附量為42mg/g，在外加磁場輔助下，用孵育緩沖液洗滌微球3次，洗去未吸附的抗體以及其他雜質(zhì)；加入42mg的