仿生流體處理的系統(tǒng)和方法
【專利說明】仿生流體處理的系統(tǒng)和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本發(fā)明基于2013年1月3日提交且標題為"Biomimetic device for generating human platelets (生成人血細胞的仿生裝置）"的美國臨時專利申請?zhí)?1/848, 424并要求 其權(quán)利，其通過引用全文納入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究/開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明是在政府支持下由國家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)授 予的基金號1K99HL114719-0IAl資助完成。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 本發(fā)明通常涉及流體系統(tǒng)，包括微流體裝置、包含這類裝置的系統(tǒng)和使用這類裝 置和系統(tǒng)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及基于仿生平臺生成功能性生物材料、物質(zhì)或試劑的 裝置、系統(tǒng)和方法。
[0007] 血液血小板（PLT)對于止血、血管發(fā)生和先天免疫而言很重要，且當數(shù)目降低至 低水平時，發(fā)生稱作血小板減少癥的病癥，患者處于因出血而死亡的嚴重風險下。低血小板 計數(shù)的一些原因包括手術(shù)、癌癥、癌癥治療、再生障礙性貧血、毒性化學品、醇、病毒、感染、 懷孕和特發(fā)性免疫血小板減少癥。
[0008] 治療這類病癥的替代PLT通常完全來源于人供體，但存在由其免疫原性導致的嚴 重臨床問題和膿毒血癥的相關(guān)風險。然而，需要更多PLT輸注所導致的不足（以及近似靜 態(tài)的供體池和由于細菌測試和惡化產(chǎn)生的短儲藏期）使得健康護理專業(yè)人員更難以為其 患者提供合適的護理。此外，替代方法（如人工血小板替代品）目前尚不能替代生理血小 板廣品。
[0009] 在體內(nèi)，PLT由祖細胞（稱為巨核細胞（MK))生產(chǎn)。在骨髓（BM)中位于血管外， MK將長、分支的細胞結(jié)構(gòu)（proPLT(前血小板））延伸至竇狀腺血管內(nèi)，其中其經(jīng)歷剪切速 率并將PLT釋放至循環(huán)中。雖然已在體外生長了功能性人PLT，但迄今為止的細胞培養(yǎng)方 法僅生成約10% proPLT生產(chǎn)且每個人MK生成10-100個PLT。相反地，人中的幾乎所有成 年MK都必須各自生產(chǎn)大致1000-10000個PLT以得到循環(huán)的PLT的數(shù)目。這構(gòu)成了離體血 小板輸注單元生產(chǎn)的主要瓶頸。雖然第二代細胞培養(yǎng)方法對PLT是否的生理驅(qū)動提供了進 一步的認識，但其無法重建整個BM微環(huán)境，對胞外基質(zhì)（ECM)組成、BM剛性、內(nèi)皮細胞接觸 或血管剪切速率具有有限的個體控制；且未能成功地同步化proPLT生產(chǎn)，導致6-8天時間 中不均勻的PLT釋放。此外，高分辨率活細胞顯微鏡顯示的不具有在生理相關(guān)條件下解決 proPLT延伸和釋放的能力顯著阻礙了鑒定PLT生產(chǎn)的細胞骨架結(jié)構(gòu)以促進藥物開發(fā)和建 立血小板減少癥的新治療方法的努力。因此，能夠生成臨床上顯著數(shù)目的功能性人PLT的 有效、供體不依賴的PLT系統(tǒng)是消除PLT獲得和儲存相關(guān)風險所必需的，并有助于滿足日益 增長的輸注需要。
[0010] 基于上述考慮，持續(xù)而明確地需要利用特定平臺的裝置、系統(tǒng)和方法，該平臺可再 生血管生理學以精確地反映影響功能性人血液血小板的有效生產(chǎn)的過程、機制和條件。這 類平臺將證明高度適用于有效地生成人血小板的目的以用于輸注，以及用于建立開發(fā)的臨 床前階段中的相互作用和藥物效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明通過提供一種仿生流體系統(tǒng)和方法克服了前述缺陷，例如用于使用代表生 理上精確的條件、環(huán)境、結(jié)構(gòu)和動力流的平臺生成功能性人血液血小板。該方法適用于血小 板缺乏病癥（如血小板減少癥）的輸注治療以及適用于藥物開發(fā)應用。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種仿生微流體系統(tǒng)，其包含基材。該系統(tǒng)還包含 基材內(nèi)形成的第一通道，其從第一入口向第一出口并沿縱向維度延伸并且沿第一橫向維度 展開。該系統(tǒng)還包含基材內(nèi)形成的第二通道，其從第二入口向第二出口沿縱向維度延伸并 且沿第二橫向維度展開。第一和第二通道基本平行地延伸。該系統(tǒng)還包含從第一通道通往 第二通道的一系列間隙由此形成在一系列柱之間通過的流體連通路徑。這些柱以預定的間 距縱向分隔。值得注意的是，該預定間距可以是均勻的或可在一定的預定距離范圍內(nèi)變化 使得間隙具有可變寬度。該系統(tǒng)還包含第一源，其與第一入口連接并配置為以第一通道流 速將至少一種第一生物組合物選擇性導入第一通道。該系統(tǒng)還包含第二源，其與第二入口 連接并配置為以第二通道流速將至少一種第二生物組合物選擇性導入第二通道。第一通道 流速和第二通道流速具有差異，其配置為生成限定在預定范圍內(nèi)的沿第二通道的生理剪切 速率并通過所述一系列間隙影響第一通道內(nèi)的流動。
[0013] 在本發(fā)明的另一個方面中，公開了一種生成血管結(jié)構(gòu)和骨髓中至少一種的物理模 型的方法。該方法包括提供了一種仿生微流體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含基材和基材內(nèi)形成的第一 通道，該第一通道從第一入口向第一出口沿縱向維度延伸并且沿第一橫向維度展開。該系 統(tǒng)還包含基材內(nèi)形成的第二通道，其從第二入口向第二出口沿縱向維度延伸并且沿第二橫 向維度展開。第一和第二通道基本平行地延伸。該系統(tǒng)還包含從第一通道通往第二通道的 一系列間隙由此形成在一系列柱之間通過的流體連通路徑。這些柱以預定的間距縱向分 隔。該系統(tǒng)還包含與第一入口連接的第一源和與第二入口連接的第二源。該方法包括使用 第一源以第一通道流速將第一生物物質(zhì)導入上通道并使用第二源以第二通道流速將第二 生物物質(zhì)導入下通道以建立第一和第二通道流速之間的差異，從而生成限定在預定范圍內(nèi) 的沿第二通道的生理剪切速率。該方法還包括收獲通過生理剪切速率在間隙近端生成的目 標生物物質(zhì)。
[0014] 通過以下說明書可以清楚地了解本發(fā)明的上述和其他方面和優(yōu)勢。在以下說明書 中，參照構(gòu)成說明書的一部分的附圖，其中以說明性方式顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。這 類實施方式不必然代表本發(fā)明的全部范圍，而是因此對權(quán)利要求進行說明并在本文中解釋 本發(fā)明的范圍。
[0015] 附圖簡要說明
[0016] 在后文中將參考附圖描述本發(fā)明，其中同樣的附圖標記表示同樣的元件。
[0017] 圖1是本發(fā)明所述仿生微流體系統(tǒng)的示意圖。
[0018] 圖2A顯示顯微圖像，顯示具有骨髓和血管蛋白的各微流體通道的涂層用以再生 胞外基質(zhì)（ECM)組成，如本發(fā)明所述。
[0019] 圖2B顯示顯微圖像，顯示選擇性包埋于藻酸鹽凝膠中的間隙或微通道中捕獲的 巨核細胞（MK)(白色箭頭），對3維ECM組織和生理骨髓（BM)剛性進行建模，如本發(fā)明所 述。
[0020] 圖2C顯示人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)的顯微圖像，其在纖維蛋白原包被的第二通 道中選擇性培養(yǎng)以生成功能性血管，如本發(fā)明所述。
[0021] 圖2D顯示完整系統(tǒng)的組合圖像。
[0022] 圖2E顯示本發(fā)明所述仿生微流體系統(tǒng)內(nèi)模擬的剪切速率分布。
[0023] 圖2F是對于若干輸注速率而言與第一通道的橫向（軸向）距離成函數(shù)的剪切速 率的示意圖，如本發(fā)明所述。
[0024] 圖2G是作為阻斷微通道（狹縫或孔）數(shù)目的函數(shù)的剪切速率的示意圖，如本發(fā)明 所述。
[0025] 圖3A描繪0和18小時時培養(yǎng)的MK的直徑分布，如本發(fā)明所述。
[0026] 圖3B是靜態(tài)培養(yǎng)物中MK的顯微圖像，顯示純化后6小時時proPLT的生產(chǎn)，如本 發(fā)明所述。
[0027] 圖3C顯示生理剪切下MK的顯微圖像，顯示捕獲后立即發(fā)生的proPLT生產(chǎn)，如本 發(fā)明所述。
[0028] 圖3D顯示與靜態(tài)培養(yǎng)物相比生理剪切下生產(chǎn)proPLT的MK百分比的增加，如本發(fā) 明所述。
[0029] 圖3E顯示與靜態(tài)培養(yǎng)物相比生理剪切下proPLT延伸速率顯著增加，如本發(fā)明所 述。
[0030] 圖4A是顯微圖像，顯示MK擠壓通過3 μ m寬的微通道，支持血管PLT生產(chǎn)的模型， 如本發(fā)明所述。
[0031] 圖4B是顯微圖像，顯示MK延伸大片段通過3 μπι寬的微通道，支持血管PLT生產(chǎn) 的模型，如本發(fā)明所述。
[0032] 圖4C是顯微圖像，顯示proPLT延伸，如本發(fā)明所述。
[0033] 圖4D是顯微圖像，顯示proPLT延伸和沿proPLT軸的不同位置處的切斷事件，如 本發(fā)明所述。
[0034] 圖4E是顯微圖像，顯示切斷后所得proPLT末端在尖部形成新的PLT大小的膨脹， 其隨后被延伸和釋放，重復該循環(huán)，如本發(fā)明所述。
[0035] 圖4F是顯微圖像，顯示生理范圍內(nèi)提高的剪切速率不會提高proPLT延伸速率，如 本發(fā)明所述。
[0036] 圖4G是顯微圖像，表明經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以表達GFP-β 1微管蛋白的MK顯示 proPLT延伸并由外周MT組成，所屬外周MT在PLT大小的末端處形成螺旋，如本發(fā)明所述。
[0037] 圖4H顯示5 μ M Jasplankinolide (Jas，肌動蛋白穩(wěn)定劑）和ImM赤 式-9-(3-[2-羥基壬基](EHNA，胞質(zhì)動力蛋白抑制劑）抑制剪切誘導的proPLT生產(chǎn)，如本 發(fā)明所述。
[0038] 圖41是顯微圖像，顯示生理剪切下proPLT生產(chǎn)的藥物誘導抑制，如本發(fā)明所述。
[0039] 圖5A顯示微流體裝置來源的mFLC-PLT表現(xiàn)血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，如本發(fā) 明所述。
[0040] 圖5B顯示培養(yǎng)第4天分離后輸注至微流體裝置中的以及輸注后2小時從微流體 裝置收集的流出液中的（GP) IX+mFLC-MK的相對濃度、正向/側(cè)向散射和生物標記物表達， 如本發(fā)明所述。
[0041] 圖5C顯示與靜態(tài)培養(yǎng)物上清液相比，剪切的應用使得GPIX+產(chǎn)物向更多PLT尺寸 的細胞變化，如本發(fā)明所述。
[0042] 圖是顯微圖像，顯示在微流體裝置中mFLC-MK在2小時內(nèi)轉(zhuǎn)化為PLT，如本發(fā)明 所述。
[0043] 圖5E顯示與靜態(tài)培養(yǎng)物上清液相比，剪切的應用使得產(chǎn)物向更多PLT尺寸的β 1 微管蛋白+Hoescht細胞變化，如本發(fā)明所述。插入頁顯示流出物中游離細胞核的定量。
[0044] 圖5F是顯微圖像，顯示微流體裝置mPLT在超微結(jié)構(gòu)上類似于小鼠血液PLT且含 有皮層MT螺旋、開放的小管系統(tǒng)、致密的微管系統(tǒng)、線粒體和特征性分泌顆粒，如本發(fā)明所 述。
[0045] 圖5G是顯微圖像，顯示微流體裝置mPLT和PLT中間體在形態(tài)上類似于小鼠血液 PLT且顯示可比的MT和肌動蛋白表達，如本發(fā)明所述。
[0046] 圖6A顯示微流體裝置來源的hiPSC-PLT具有血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，其中 hiPSC-MK在培養(yǎng)第15天達到最大直徑（20-60 μ m)，如本發(fā)明所述。
[0047] 圖6B是顯微圖像，顯示hiPSC-MK在超微結(jié)構(gòu)上類似于原代人MK且含有分成小葉 的細胞核、內(nèi)陷的膜系統(tǒng)、糖原貯積、細胞器和特征性分泌顆粒，如本發(fā)明所述。
[0048] 圖6C是顯微圖像，顯示靜態(tài)培養(yǎng)物中的hiPSC-MK在純化后6小時開始生產(chǎn) proPLT并在18小時達到最大proPLT生產(chǎn)，如本發(fā)明所述。
[0049] 圖6D是顯微圖像，顯示生理剪切下（約500s 4的hiPSC-MK在捕獲后立即開始生 產(chǎn)proPLT，并在培養(yǎng)的最初2個小時內(nèi)延伸/釋放proPLT，如本發(fā)明所述。
[0050] 圖6E顯示與靜態(tài)培養(yǎng)物相比生理剪切下生產(chǎn)proPLT的hiPSC-MK百分比的顯著 增加，如本發(fā)明所述。
[0051] 圖6F顯示生理剪切下proPLT延伸速率是約19 μ m/分鐘，如本發(fā)明所述。
[0052] 圖6G是顯微圖像，顯示微流體裝置來源的hPLT在超微結(jié)構(gòu)上類似于人血液PLT 且含有皮層MT螺旋、開放的小管系統(tǒng)、致密的微管系統(tǒng)、線粒體和特征性分泌顆粒，如本發(fā) 明所述。右上方插頁顯示外周MT螺旋。
[0053] 圖6H是顯微圖像，顯示微流體裝置來源的hPLT在形態(tài)上類似于人血液PLT且顯 示可比的MT和肌動蛋白表達，如本發(fā)明所述。
[0054] 圖61是顯微圖像，顯示微流體裝置來源的mPLT激活形成絲狀偽足/板狀偽足并 在玻璃表面上鋪展，如本發(fā)明所述。