一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，特別涉及利用基因工程改造的工業(yè)微生物生產(chǎn)L-蘇氨 酸的領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前工業(yè)上多采用發(fā)酵法生產(chǎn)蘇氨酸。歐美國(guó)家的蘇氨酸生產(chǎn)水平要明顯高于 我國(guó)，如德國(guó)的德固賽公司、美國(guó)的ADM公司等應(yīng)用先進(jìn)的分子操作技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行改造， 使蘇氨酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率有了巨大的提高。目前國(guó)際菌種發(fā)酵水平為150g/L，發(fā)酵周期為 36_48h，轉(zhuǎn)化率高于50%。國(guó)內(nèi)無(wú)論是發(fā)酵產(chǎn)量還是轉(zhuǎn)化率均低于國(guó)際水平。
[0003] 蘇氨酸高產(chǎn)菌的獲得，一方面是采用基因工程的手段對(duì)菌株進(jìn)行理性改造，另一 方面是通過(guò)物理誘變或者化學(xué)誘變后篩選產(chǎn)量提高的菌株，并且后者為獲得高產(chǎn)菌株的一 種重要手段。
[0004] 發(fā)酵液中蘇氨酸的檢測(cè)是篩選過(guò)程中主要的瓶頸之一。目前在檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨 酸含量時(shí)，主要包括紙層析法和高校液相色譜等。紙層析法使用設(shè)備較少，成本低廉，但是 每次測(cè)量需要3-4小時(shí)，并且準(zhǔn)確率比較低，誤差可達(dá)10%左右，因此不能迅速的提供指導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。高效液相色譜可以提供精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是該方法所采用的儀器昂貴，不能 廣泛推廣。
[0005] 另外，測(cè)定蘇氨酸含量的方法還包括高氯酸電位滴定法，此法只能局限于測(cè)定固 定樣品，不能進(jìn)行發(fā)酵液中蘇氨酸含量的測(cè)定。
[0006] 因此，本領(lǐng)域尚需開(kāi)發(fā)一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨酸含量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨酸含量的 方法。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)樣品中蘇氨酸含量的方法，所述方法包括以下 步驟：
[0009] (i)將樣品與第一反應(yīng)溶液混合均勻，得到第一混合溶液；
[0010] (ii)將所述第一混合溶液置于4土 rc放置10-90min后恢復(fù)溫度至15-30°c ;
[0011] (iii)將第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液混合均勻得到第二混合溶液；
[0012] (iv)檢測(cè)所述第二混合溶液的OD34。，每隔1-5分鐘檢測(cè)一次，共檢測(cè)5-7次；
[0013] (V)以檢測(cè)時(shí)間和對(duì)應(yīng)的OD34。作圖，計(jì)算斜率即為樣品的OD34。降低速率；
[0014] (Vi)將計(jì)算得到的OD34。的降低速率與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，得到所述發(fā)酵液中蘇 氨酸含量，
[0015] 其中，所述第一反應(yīng)溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脫氫酶、DTT和水；
[0016] 所述第一混合溶液中含有 10-500mM HEPES buf f er、100 μ M-1000 μ M NADH、 10 μ Μ-100 μ M PLP、1U-50U 乙醇脫氫酶和 0· DTT ;
[0017] 所述第二反應(yīng)溶液中含有1-20U LTA，余量為水。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合溶液中含有50-400mM HEPES buffer、100yM~ 800 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~35U 乙醇脫氫酶和 0· 5mM ~5mM DTT。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（i)中將樣品稀釋后與所述第一反應(yīng)溶液混合均勻，稀 釋后的樣品中蘇氨酸的濃度為0. 1-lOmM。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，稀釋后的樣品與第一反應(yīng)溶液的體積比為1:1-5。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合溶液與所述第二反應(yīng)溶液的體積比為1-5:1。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，通過(guò)以下步驟獲得所述標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0023] (a)將濃度范圍為0.1 mM~8mM的數(shù)個(gè)濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液分別與第一反 應(yīng)溶液混合均勻，得到第一混合溶液；
[0024] (b)將所述第一混合溶液置于4土 1°C放置10_90min后恢復(fù)溫度至15-30°C ;
[0025] (c)將第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液混合均勻得到第二混合溶液；
[0026] ⑷檢測(cè)所述第二混合溶液的OD34。，每隔1-5分鐘檢測(cè)一次，共檢測(cè)5-7次；
[0027] (e)以測(cè)定時(shí)間和對(duì)應(yīng)的OD34。為坐標(biāo)作圖，計(jì)算斜率為OD34。降低速率；
[0028] (f)以標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液的濃度及對(duì)應(yīng)的OD34。降低速率為坐標(biāo)，繪制得到所述標(biāo)準(zhǔn) 曲線，
[0029] 其中，步驟（a)中所述第一反應(yīng)溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脫氫酶、 DTT和水；
[0030] 步驟（a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、 100 μ Μ-1000 μ M NADH、10 μ Μ-100 μ M PLP、1U-50U 乙醇脫氫酶和 0· DTT ;
[0031] 所述第二反應(yīng)溶液中含有1-20U LTA，余量為水。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合溶液中含有50-400mM HEPES buffer、100yM~ 800 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~35U 乙醇脫氫酶和 0· 5mM ~5mM DTT。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合溶液中含有50-200mM HEPES buffer、100yM~ 500 μ M NADH、20 μ M ~80 μ M PLP、1U ~5U 乙醇脫氫酶和 0· 5mM ~I. 5mM DTT。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟b)中標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液與第一反應(yīng)溶液的體積比為 1:1-5 ;和 / 或
[0035] 所述步驟d)中所述第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液的體積比為1-5:1。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)樣本中蘇氨酸含量與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立同時(shí)進(jìn)行。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述LTA來(lái)源于銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒 酵母、假絲酵母、念珠菌中的一種或兩種以上。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，步驟（a)配制8個(gè)濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液，濃度分別為 0. 2mM、0. 5mM、lmM、2mM、3mM、4：mM、5mM、6mM。
[0039] 本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)發(fā)酵液中蘇氨酸含量，克服現(xiàn)有 技術(shù)中設(shè)備昂貴，操作繁瑣，測(cè)量耗時(shí)等不足。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果圖。
[0042] 圖2為實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0043] 圖3為蘇氨酸濃度與NADH降低速率曲線。
[0044] 圖4為雙酶法檢測(cè)蘇氨酸含量的線性范圍。
[0045] 圖5為M9+酵母粉培養(yǎng)基中蘇氨酸含量及NADH降低速率曲線。
[0046] 圖6為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中蘇氨酸含量及NADH降低速率曲線。
[0047] 圖7為采用本發(fā)明方法（酶偶聯(lián)法）和HPLC方法檢測(cè)蘇氨酸含量結(jié)果圖，各時(shí)間 點(diǎn)處第一柱（左柱）為HPLC檢測(cè)結(jié)果，第二柱（右柱）為本發(fā)明酶偶聯(lián)法檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入地研究，首次意外研發(fā)出一種快速檢測(cè)發(fā)蘇氨酸 含量的方法，以LTA酶作為工具酶并將NADH的降低速率與蘇氨酸的產(chǎn)量相偶聯(lián)。L-蘇氨 酸酸縮酶（L-threonine aldolase, LTA)能催化L-蘇氨酸生成甘氨酸和乙酸及其逆反應(yīng)， 在LTA及吡哆醛磷酸鹽（PLP)存在時(shí)，蘇氨酸會(huì)被分解為乙醛和甘氨酸，乙醛被乙醇脫氫 酶（ADH)還原為乙醇，同時(shí)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)被氧化為NAD +,通過(guò)0D34(]nm檢測(cè) NADH的變化速率確定蘇氨酸的含量。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0049] 檢測(cè)方法
[0050] 本發(fā)明提供的檢測(cè)樣品中蘇氨酸含量的方法，包括以下步驟：
[0051] (i)將樣品與第一反應(yīng)溶液混合均勻，得到第一混合溶液；
[0052] (ii)將所述第一混合溶液置于4土 1°C放置10_90min后恢復(fù)溫度至15_30°C ;
[0053] (iii)將第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液混合均勻得到第二混合溶液；
[0054] (iv)檢測(cè)所述第二混合溶液的OD34。，每隔1-5分鐘檢測(cè)一次，共檢測(cè)5-7次；