一種用于黃曲霉毒素b1富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黃曲霉毒素 Bl樣本的富集凈化處理工藝，具體涉及一種用于黃曲霉 毒素 Bl富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素 BI (Aflatoxin Bl簡(jiǎn)寫(xiě)為AFBl)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，?有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?。黃曲霉毒素 Bl是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌 性最強(qiáng)的一種。黃曲霉毒素 Bl對(duì)包括人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì) 肝臟的損害。在天然食物中以黃曲霉毒素 Bl最為多見(jiàn)，危害性也最強(qiáng)，國(guó)家質(zhì)檢總局規(guī)定 黃曲霉毒素 Bl是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。中國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了幾種主要易受 污染的食物中黃曲霉毒素 Bl的允許量標(biāo)準(zhǔn)，玉米、花生、花生油中黃曲霉毒素 Bl允許量為 < 20 μ g/kg ;其他食用油為< 10 μ g/kg ;其他糧食、豆類、發(fā)酵食品為< 5 μ g/kg。
[0003] 目前食品中黃曲霉毒素 BI的主要提取方法包括有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析 法等。有機(jī)溶劑萃取法是目前最普遍的提取方法，但有機(jī)溶劑的萃取存在過(guò)程復(fù)雜、毒性 大、所需時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而且由于最終提取物中可能存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物， 從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾；免疫親和層析提高了試樣的凈化效果，同時(shí)可顯著減少有毒有 害試劑的使用，但樣品前處理較復(fù)雜，所用設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也比較 高，不適合于大批量樣本檢測(cè)及大范圍推廣的應(yīng)用。
[0004] 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年來(lái)發(fā) 展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可結(jié)合活性蛋白 質(zhì)抗體，又可被磁鐵吸引，經(jīng)過(guò)處理后，可將抗體結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體的載體，磁珠 上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁力 作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，而達(dá)到分離特異性抗原的目的。免疫磁珠 (Hffi)是一個(gè)平臺(tái)，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進(jìn)行工作的領(lǐng)域都可以應(yīng)用，并且已在醫(yī)學(xué) 和生物學(xué)的骨髓移植、分離干細(xì)胞、細(xì)胞器、癌細(xì)胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了顯 著成績(jī)。近年來(lái)以其高度的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于食品、水、生物樣品、環(huán)境等 標(biāo)本中真菌毒素的分離和檢測(cè)工作中，顯示出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0005] 在分離真菌毒素方面，頂B可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量真菌毒素，可避 免有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法提取時(shí)存在的缺點(diǎn)。對(duì)目的毒素的富集具有高分離 率、高特異性、高穩(wěn)定性、無(wú)污染、無(wú)毒性、操作簡(jiǎn)便、樣品用量少且不會(huì)破壞毒素結(jié)構(gòu)等優(yōu) 點(diǎn)，與常規(guī)方法相比，不需要多加純化步驟去除雜質(zhì)，可直接對(duì)真菌毒素產(chǎn)生富集分離純化 的效果，并可在2-5h內(nèi)完成。并且磁珠上偶聯(lián)的抗體可準(zhǔn)確識(shí)別真菌毒素上的特征基團(tuán)， 從而減少漏檢，減少安全隱患。
[0006] 本發(fā)明利用磁珠與抗體的偶聯(lián)原理對(duì)可富集黃曲霉毒素 Bl的免疫磁珠的制備工 藝及應(yīng)用條件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了對(duì)黃曲霉毒素 Bl的富集能力和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)憑 借免疫磁珠自身的快速方便、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于谷物及飼料中黃曲霉毒素 BI的 分離與富集，可以進(jìn)一步提高快速檢測(cè)黃曲霉毒素 Bl的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于黃曲霉毒素 Bl富 集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用，以解決黃曲霉毒素 Bl樣品凈化分離操作復(fù)雜、分 離效率低、存在較大安全隱患的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：提供一種用于黃曲霉毒素 Bl富 集凈化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶聯(lián)有黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體；所述黃曲霉毒素 Bl 單克隆抗體是用黃曲霉毒素 Bl人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黃曲霉毒素 Bl人工抗原 是黃曲霉毒素 Bl半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0010] 所述黃曲霉毒素 Bl半抗原是按照如下方法制備得到的：
[0011] 62mg黃曲霉毒素 Bl溶于ImL二甲基亞砜（DMS0)，60°C下緩慢滴加入25mg對(duì)苯二 胺和0.1 mL吡啶在ImL DMSO的混合液中，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)15h，旋蒸除去溶劑，柱層析 純化后得到黃曲霉毒素 Bl的對(duì)苯二胺單縮合物，得到黃曲霉毒素 Bl半抗原，得率90%。
[0012] 所述黃曲霉毒素 Bl人工抗原是按照如下方法制備得到的：
[0013] 取半抗原9. 4mg，用2mL 0. lmol/L HCl溶解，得到溶液A。取亞硝酸鈉20mg用ImL 水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化鉀試紙檢測(cè)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min。取50mg BSA，用 4mL水溶解，得到溶液B。將溶液A緩慢加入到溶液B中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。用0. 02mol/ L的PBS透析三天，每天更換透析液三次，得到黃曲霉毒素 BI人工抗原。
[0014] 所述黃曲霉毒素 Bl半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0015]
[0016] 本發(fā)明還提供了一種上述免疫磁珠的制備方法，是以粒徑2. 8 μπι的羧基磁珠為 載體，羧基磁珠末端具有反應(yīng)活性的羧基基團(tuán)，在經(jīng)活化劑H)C-NHS組合處理后，活化磁 珠可與黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備成能夠富集凈化黃曲霉毒素 Bl的免疫磁 珠；
[0017] 上述免疫磁珠的制備方法具體描述如下：
[0018] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于離心管中，用IOOyL含0.05%吐溫-20的ρΗ5·0、 25mmol/L的MES溶液洗滌2次，磁分離后移除上清；
[0019] (2)活化：用 4°C貯存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分別配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分別加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勾，室溫活 化30min，磁分離后移除上清，同（I)MES溶液洗滌2-3次；
[0020] (3)偶聯(lián)：將黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體溶解到60 μ L pH5. 0、25mmol/L MES溶液 中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ L，輕柔加入到已活化磁珠中，室溫偶聯(lián)30min或 4°C偶聯(lián)2h，期間使磁珠保持混勻狀態(tài)；
[0021] ⑷封閉：磁分離后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反應(yīng)15min封閉磁 珠；
[0022] (5)保存：磁分離后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐溫-20的TRIS溶液洗滌封閉好的磁珠3-5次，磁分離后移除上清，將磁珠復(fù)溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐溫-20、0· 02% NaN3的 TRIS 溶液中，2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0023] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述免疫磁珠在富集凈化黃曲霉毒素 Bl中的應(yīng)用。
[0024] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明用于黃曲霉毒素 Bl富集凈化的免疫磁珠對(duì)黃曲霉毒素 Bl有很 高的富集率和回收率，對(duì)黃曲霉毒素 Bl的富集率為25ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕獲 25ng黃曲霉毒素 BI)，對(duì)黃曲霉毒素 Bl的回收率達(dá)到85%以上。本發(fā)明用于黃曲霉毒素 B1富集凈化的免疫磁珠可以高效、準(zhǔn)確、可靠、快速、簡(jiǎn)便地把待檢樣品中的黃曲霉毒素 B1 富集起來(lái)，以便進(jìn)一步應(yīng)用于化學(xué)分析儀器檢測(cè)（HPLC，高效液相色譜法）、酶聯(lián)免疫吸附 法檢測(cè)和膠體金測(cè)試條的快速測(cè)試，具有濃縮待測(cè)樣品中黃曲霉毒素 Bl濃度、提高檢測(cè)下 限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品處理時(shí)間達(dá)到快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1黃曲霉毒素 Bl半抗原合成路線圖
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn) 方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，即為可從商業(yè)途 徑得到的試劑和材料。
[0027] 實(shí)施例1用于黃曲霉毒素 Bl富集凈化的免疫磁珠的制備
[0028] 本實(shí)施例給出了由黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體和含羧基的免疫磁珠偶聯(lián)得到的偶 聯(lián)物作為富集凈化黃曲霉毒素 Bl的免疫磁珠的制備方法。該方法包括：
[0029] -、黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體的制備
[0030] 1、黃曲霉毒素 Bl半抗原的合成（合成路線見(jiàn)附圖1)及鑒定
[0031] 62mg黃曲霉毒素 Bl溶于ImL二甲基亞砜（DMS0)，60°C下緩慢滴加入25mg對(duì)苯二 胺和0.1 mL吡啶在ImL DMSO的混合液中，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)15h，旋蒸除去溶劑，柱層析 純化后得到黃曲霉毒素 Bl的對(duì)苯二胺單縮合物，得到黃曲霉毒素 Bl半抗原，得率90%。
[0032] 取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，7. Oppm左右增加的2組芳環(huán)信號(hào)峰，說(shuō)明半 抗原合成成功。
[0033] 2、黃曲霉毒素 Bl人工抗原的合成及鑒定
[0034] 取半抗原9. 4mg，用2mL 0. lmol/L HCl溶解，得到溶液A。取亞硝酸鈉20mg用ImL 水溶解，逐滴加入到溶液A中。用碘化鉀試紙檢測(cè)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min。取50mg BSA，用 4mL水溶解，得到溶液B。將溶液A緩慢加入到溶液B中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。用0. 02mol/ L的PBS透析三天，每天更換透析液三次，得到黃曲霉毒素 BI人工抗原，分裝后-20°C保存。
[0035] 按合成黃曲霉毒素 Bl人工抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn) 行紫外（200nm~400nm)掃描測(cè)定，通過(guò)比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計(jì)算其 結(jié)合比。偶聯(lián)物黃曲霉毒素 Bl半抗原-BSA的最大吸收峰與黃曲霉毒素 Bl半抗原、BSA的 最大吸收峰相比發(fā)生了明顯的變化，表明黃曲霉毒素 Bl半抗原-BSA的合成是成功的。經(jīng) 計(jì)算，半抗原與BSA的結(jié)合比為15:1。
[0036] 3、黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體的制備
[0037] (1)雜交瘤細(xì)胞的獲得
[0038] 1)首次免疫：將黃曲霉毒素 Bl半抗原-BSA偶聯(lián)物（免疫原）與等量的弗氏完全 佐劑充分乳化，皮下注射6周齡的Balb/c小鼠，每只0. 2mL ;
[0039] 2)加強(qiáng)免疫兩次：從首次免疫開(kāi)始，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，用弗式不完全佐劑代 替弗氏完全佐劑，方法和劑量同首次免疫；
[0040] 3)最后一次加強(qiáng)免疫一周后眼底靜脈采血測(cè)效價(jià)和抑制，有抑制且效價(jià)達(dá)到 1:10000以上時(shí)進(jìn)行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐劑的免疫原溶液0. lmL，三天后 處死小鼠，取其脾臟與骨髓瘤細(xì)胞融合；
[0041] 4)采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋 法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，得到并建立穩(wěn)定分泌黃曲霉毒素 Bl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株， 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)