人肺炎鏈球菌量子點免疫層析檢測卡及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測技術領域，具體為一種人肺炎鏈球菌量子點免疫層析檢測卡 及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 人肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原 體。主要經(jīng)飛沫傳播而進入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發(fā) 病率和病死率的主要病原菌。其中，在發(fā)展中國家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為 嚴重。肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur)及G.M. Sternberg分別在法 國及美國從患者痰液中分離出。其為革蘭氏染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排 列的雙球菌，有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜。其莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌 分型的依據(jù)。根據(jù)莢膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個血清型。其菌體抗原主要 為C多糖，其存在于肺炎鏈球菌細胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖可被 血清中C-反應蛋白沉淀。在鈣離子存在時，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應蛋白（C reactive protein, CRP)的β球蛋白結合，發(fā)生沉淀。目前針對人肺炎鏈球菌抗原的檢測 亦主要是針對此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。在肺炎 鏈球菌表面還有一種與毒力相關的重要抗原，為肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所 有肺炎鏈球菌血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。但是PspA分子結構高度變異，具有 抗原多樣性，其富含脯氨酸的結構域上游被稱為CDR域，具有多樣性。根據(jù)CDR域的不同將 PspA 分為 3 個家族 6 亞類：Cladel, Clade2, Clade3, Clade4, Clade5, Clade6。其中 Cladel， Clade2 屬于 Faml 家族；Clade3，Clade4，Clade5 屬于 Fam2 家族，Clade6 屬于 Fam3 家族。 具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的人肺炎鏈球菌種類的 99 %以上。研究表明同一家族亞類間PspA蛋白間存在廣泛的抗原抗體交叉反應,而異家族 亞類間則無此交叉反應。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體（如肺炎支原體、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實驗室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明 確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管肺炎鏈球菌在全球范圍內(nèi)傳播，嬰幼兒的感染尤其普遍，但可用于實驗室診 斷的標準化商品試劑的種類極少。目前，肺炎鏈球菌的檢測主要有以下幾種方法：
[0005] 一、常規(guī)實驗室檢測
[0006] 1、細菌分離
[0007] 實驗室診斷肺炎鏈球菌的金標準是分離人肺炎鏈球菌毒株。采用鼻咽分泌物作為 病原體分離的標本，可以用血培養(yǎng)的方法分離病原體。但是該法有嚴重的缺陷，因為肺炎鏈 球菌是苛養(yǎng)菌，營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)所需時間長，陽性率低，更重要的是，若采樣前患者使用過 抗菌藥物，會造成培養(yǎng)結果的假陽性。這樣在臨床方面對病人的治療就有一定的局限性。
[0008] 2、血清學檢測
[0009] 即采用酶聯(lián)免疫法、放免法、微量免疫熒光法等，檢測被檢者血清中肺炎鏈球菌抗 體水平，可間接提示肺炎鏈球菌感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時檢測患者急性期和恢復期的雙份血清，如果恢復期中抗人肺炎鏈球菌抗體 效價比急性期高4倍或4倍以上才有診斷意義。另外，抗體出現(xiàn)的時機不易掌握，且因為菌 體血清型種類過多，導致其誘生的抗莢膜多糖抗體種類過多，對抗體的檢測造成了很大的 困難，故現(xiàn)有血清學方法的檢測質(zhì)量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人肺炎鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達到快速診斷的目的，目前主要有 免疫熒光法、免疫酶法和PCR法等。免疫熒光法和免疫酶法均不能進行一步檢測，均存在操 作步驟復雜，需要專業(yè)人員操作，檢測時間長（2h以上），成本較高等缺點。PCR方法快速、 靈敏、特異，是目前研究肺炎鏈球菌感染的重要手段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求 較高，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。目前，檢測人肺炎鏈球菌 抗原的方法主要為膠體金法檢測其C多糖抗原，但是膠體金法敏感度較低，對待檢樣品材 料質(zhì)量要求較高，同時還存在與其他鏈球菌如緩和鏈球菌存在交叉反應等缺陷。因此，建立 具備高靈敏度的人肺炎鏈球菌特異性抗原快速診斷法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明針對【背景技術】中現(xiàn)存的幾種人肺炎鏈球菌在檢測方式中遇到的技術瓶頸， 提出了一種具有操作簡便、檢測快速、可定量及高靈敏度等優(yōu)點的人肺炎鏈球菌量子點免 疫層析檢測卡及其制備方法和應用。
[0013] 本發(fā)明的目的是通過以下技術手段來實現(xiàn)的：
[0014] 一種人肺炎鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述人肺炎鏈球菌量子 點免疫層析檢測卡包括底板、樣品墊、結合墊、檢測層以及吸水墊；所述結合墊包被有量子 點標記的抗人肺炎鏈球菌納米探針；所述檢測層是由帶有一條檢測線及一條質(zhì)控線的固相 硝酸纖維素膜構成；所述檢測線包被有鼠抗人肺炎鏈球菌PspA蛋白多克隆抗體；所述質(zhì)控 線包被有抗兔IgG ;所述檢測層粘貼在底板上；所述結合墊以及吸水墊分別設置在檢測層 兩端部的上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層以及底板粘貼在一起；所述樣品墊設置 在結合墊上方且與結合墊部分重合后分別與結合墊及底板粘貼在一起。
[0015] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS 量子點。
[0016] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0017] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的檢測層長2cm，所述檢測層粘貼在長度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中間段；所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是2. 5-3cm的吸水墊重 疊0. 2-0. 4cm ;所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是0. 5-0. 8cm的結合墊重 疊0. 2-0. 4cm ;所述結合墊與粘貼在結合墊以及底板上的長度是2. 5cm的樣品墊重疊0. 2- 0. 4cm ;所述檢測線與質(zhì)控線的間距是0. 5-0. 8cm ;所述底板的寬度是0. 3-0. 5cm。
[0018] 作為優(yōu)選,本發(fā)明所采用的吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。
[0019] -種基于上述的人肺炎鏈球菌量子點免疫層析檢測卡的制備方法，其特征在于： 所述制備方法包括以下步驟：
[0020] 1)結合墊的制備：
[0021] I. 1)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的制備、純化：
[0022] I. I. 1)對人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白進行生物信息學分析，分別獲 取人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到 其對應的基因序列；
[0023] I. 1. 2)在步驟I. I. 1)中所得到的基因序列的5'端及3'端分別引入酶切位點并 分別化學合成全基因序列，同時標記記為PspAl、PspA2 ;其序列參見序列表；
[0024] I. 1. 3)將步驟I. 1. 2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學方法分別克隆入表 達載體pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組 PspAl-HiS、PSpA2-His融合蛋白均以可溶性表達形式存在于基因工程菌體中；
[0025] I. 1. 4)用鎳柱純化步驟I. L 3)所得到的重組PspAl-His、PspA2_His融合蛋白， SDS-PAGE檢測其純度后，再以Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整二種蛋白濃度均為0. 2mg/ mL后備用；
[0026] 1. 2)兔及鼠抗人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0027] 1. 2. 1)以步驟I. L 4)中所得到的重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白為完全抗 原，分別免疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋 白抗血清及鼠抗人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎鏈球菌 Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清及鼠抗重組人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗 血清的間接ELISA效價均大于I X IO5 ;
[0028] 1. 2. 2)采用Protein G親和層析柱分別純化兔抗人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清及鼠抗人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白抗血清中的多克隆抗體 IgG ；
[0029] 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟1. 2. 2)所得到的四種多克 隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為3mg/mL后備用；
[0030] 1. 3)量子點標記的抗人肺炎鏈球菌納米探針的制備與純化：
[0031] 1. 3. 1)向微量離心管中依次加入4nmol量子點、600nmol N-羥基琥珀酰亞胺和 600nmol碳二亞胺，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，于旋轉混合儀中，以15rpm/min，37°C反應 30min后，透析去除過量的N-羥基琥珀酰亞胺以及碳二亞胺；所述磷酸鹽緩沖液中各組分 含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫鈉以及2g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖 液的 pH = 7. 3 ;
[0032] 1. 3. 2)在活化的量子點中，加入4_16nmol的步驟1. 2)所制備的兔抗人肺炎鏈球 菌Faml PspA蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h，加入端氨基化聚乙二醇至終濃度為1. 5%， 封閉未反應的活化羧基位點，繼續(xù)避光反應Ih ;用0. 2 μ m PES濾器過濾除去抗體聚集物， 然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā) 生偶聯(lián)反應的抗體和反應中的副產(chǎn)物；收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶 于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C 下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，至 此制得量子點標記的抗人肺炎鏈球菌Faml PspA蛋白多克隆抗體IgG ;
[0033] 所述磷酸鹽洗滌液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫 鈉、2g/L氯化鈉、5ml/L吐溫-20以及l(fā)g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7. 3 ;所述磷 酸鹽保存液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫鈉、2g/L氯化鈉、 10g/L BSA以及l(fā)g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7. 3 ;
[0034] 1. 3. 3)按照與步驟1. 3. 1)以及步驟1. 3. 2)相同的方法，利用步驟1. 2)所制備的 兔抗人肺炎鏈球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗體IgG制得量子點標記的抗人肺炎鏈球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗體IgG ;
[0035] 1. 3. 4)將上述含量子點標記的抗人肺炎鏈球菌Faml PspA蛋白多克隆抗體IgG的 溶液與含量子點標記的抗人肺炎鏈球菌Fam2 PspA蛋白多克隆抗體IgG的溶液按體積比1 : 1混合，即制得量子點標記的抗人肺炎鏈球菌納米探針，備用；
[0036] 1. 4)量子點標記抗體的負載：
[0037] 將聚酯纖維膜浸入步驟1. 3. 4)所得到的量子點標記的抗人肺炎鏈球菌納米探針 溶液中l(wèi)h，取出，25°C干燥后4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結合墊；
[0038] 2)樣品墊的制備：
[0039] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h以上，再置 于生物安全柜內(nèi)37°C通風干燥后，25°C密封干燥保存；至此制得樣品墊；
[0040] 所述樣品墊處理液中各組分含量分別為：2. 9g/L磷酸氫二鈉、0. 295g/L磷酸二氫 鈉、2g/L氯化鈉、20g/L牛血清白蛋白（BSA)、10ml/L吐溫-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯 吡咯烷酮；所述樣品墊處理液的pH = 7. 3 ;
[0041] 3)檢測層的制備：
[0042] 3. 1)將步驟1. 2. 3)中制備的鼠抗人肺炎鏈球菌Faml PspA蛋白多克隆抗體