一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料和金納米棒之間發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移檢測赭曲霉毒素a的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] -種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料和金納米棒之間發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移檢測赭曲霉毒 素A的方法，涉及納米材料和分析化學技術(shù)領(lǐng)域，用于對食品中赭曲霉毒素A進行檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素（Ochratoxins，0T)是由曲霉屬和青霉屬中的某些菌種產(chǎn)生的有 毒代謝物，是異香豆素聯(lián)結(jié)L-苯丙氨酸在分子結(jié)構(gòu)上類似的一族化合物。赭曲霉毒素 (0T)主要包括赭曲霉毒素A(0ΤΑ)、赭曲霉毒素Β(0ΤΒ)、赭曲霉毒素C(0TC)、赭曲霉毒素 D(OTD)等七種，其中以0ΤΑ為主，0ΤΑ的毒性最強、污染最為嚴重、分布最為廣泛。0ΤΑ主 要由純綠青霉（PenicilliumVerrucosum)、赫曲霉（Aspergillusachraceus)和碳黑曲霉 (A.carbonarius)三種真菌產(chǎn)生。主要危及人和動物的腎臟，動物實驗表明：0ΤΑ是一種具 有強烈腎臟毒性和肝臟毒性的真菌毒素，并具有致癌、致畸、致突變、神經(jīng)毒性和免疫抑制 等毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。0ΤΑ在自然界分布廣泛，主要存在于糧谷類 食品、咖啡、牛奶、啤酒、茶葉等中。因此，建立準確、靈敏、快速的0ΤΑ檢測技術(shù)對于食品安 全具有重大意義。
[0003] 目前檢測0ΤΑ的主要方法有薄層色譜法（TLC)、高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜 質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)和膠體金免疫層析分析法（GICA)等。ELISA 主要用于0ΤΑ現(xiàn)場快速檢測和大批量樣品篩選，它與GICA-樣都是基于抗原抗體親和反 應(yīng)，一抗體作為識別分子。但抗體易受外界條件影響，尤其是溫度，而且抗體的制備需要經(jīng) 過動物或者細胞實驗，繁瑣費時，成本較高，相應(yīng)的檢測成本也偏高。所以開發(fā)一種快速方 便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、成本低廉的新型檢測方法是很有必要的。
[0004] 核酸適配體（Aptamer)通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（systematicevolutionof ligandsbyexponentialenrichment，SELEX)技術(shù)從體外篩選得到的，能與相應(yīng)配體專一 性緊密結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸序列。這種寡核苷酸序列形成的高級結(jié)構(gòu)能夠識別與之對 應(yīng)的任何類型的蛋白和低分子等靶物質(zhì)，并與靶物質(zhì)具有高度親和力。與抗體相比，適配體 的靶分子范圍廣，體外篩選，易人工合成和修飾，分子較小，穩(wěn)定性好，對溫度不敏感，容易 保存，而且適配體作為識別分子已經(jīng)在臨床診斷、臨床治療、藥物運輸、蛋白質(zhì)組研究和食 品安全中得到廣泛應(yīng)用。
[0005] 近年來納米材料與分析化學兩者的結(jié)合越來越緊密，新型納米材料在分析檢測中 的發(fā)展前景也越來越廣大，并涌現(xiàn)出了很多具有優(yōu)秀特性的納米材料。其中上轉(zhuǎn)換發(fā)光納 米材料和金納米棒具備獨特的功能被人們所熟知。
[0006] 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（UpconversionNanoparticles)的發(fā)光機理是基于雙光子 或者多光子機制將長波長的激發(fā)光轉(zhuǎn)換成短波長的發(fā)射光的過程，是一種將紅外光轉(zhuǎn)變成 可見光的有效途徑。相對于傳統(tǒng)的有機熒光染料和其他熒光納米材料，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材 料作為完全惰性的無機發(fā)光材料具有很大的優(yōu)勢，光化學穩(wěn)定，檢測背景低，穿透性強，可 以選擇不同的基質(zhì)材料和摻雜離子來調(diào)節(jié)上轉(zhuǎn)換發(fā)光，真正實現(xiàn)單激發(fā)多發(fā)射，有利于生 物體系中多組分同時檢測。鑒于上述優(yōu)點，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料已成為一種優(yōu)秀的生物標 記材料。金納米棒在紫外-可見-近紅外（UV-Vis-NIR)波段具有獨特的可調(diào)節(jié)表面等離 子體共振（SPR)光學性質(zhì)，其良好的穩(wěn)定性、低生物毒性、亮麗的色彩和在催化、生物醫(yī)藥、 分析化學、食品安全等領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景受到了廣泛關(guān)注。
[0007] 本發(fā)明首先通過調(diào)節(jié)金納米棒的縱向表面等離子體共振吸收峰的位置，合成了能 夠與上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的發(fā)光光譜實現(xiàn)有效重疊的金納米棒，縱向等離子體共振吸收峰 峰為660nm左右，并分別在上轉(zhuǎn)換納米材料上修飾0ΤΑ適配體和在金納米棒上修飾互補寡 核苷酸鏈，分別組成能量供體探針和能量受體探針，基于兩者堿基互補配對原則，使得能量 供體探針和能量受體探針之間的距離拉近，發(fā)生發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號 的淬滅。當加入不同數(shù)量的0ΤΑ時，0ΤΑ與適配體進行特異性結(jié)合，使得雙鏈結(jié)構(gòu)解離，上轉(zhuǎn) 換發(fā)光納米材料與金納米棒之間的距離變大，上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號得以恢復，以980nm激光作 為激發(fā)光源記錄上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測信號，通過對不同濃度赭曲霉毒素A標準品的檢測，建立 標準曲線，達到對含赭曲霉毒素A樣品進行定量檢測的目的。該發(fā)明可以用于啤酒、玉米、 谷物、飼料及其制品等樣品中赭曲霉毒素A含量的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] -種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料和金納米棒之間發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移檢測赭曲霉毒 素A的方法：分別制備得到NaYF4:Yba2S6,EraffiS6上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料和金納米棒（縱橫比 為2. 5)，對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料進行表面功能化修飾并與親和素（Avidin)偶聯(lián)，隨后金納 米棒利用Au-S鍵的作用與巰基化適配體互補寡核苷酸鏈結(jié)合成為能量受體探針，上轉(zhuǎn)換 發(fā)光納米材料通過親和素（Avidin)與生物素（Biotin)之間的作用與生物素（Biotin)修 飾的適配體DNA特異性結(jié)合稱為能量供體探針。將兩者經(jīng)過一段時間的孵育，通過DNA互補 雜交使得兩者組裝成為復合納米材料，發(fā)生發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號的淬 滅，利用980nm激光激發(fā)，此時的發(fā)光信號為最小值。當加入目標分析物赭曲霉毒素A時， 適配體DNA的空間構(gòu)象發(fā)生改變，與赭曲霉毒素A發(fā)生特異性結(jié)合，使得適配體DNA與互補 單鏈DNA解鏈，從而導致上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料與金納米棒分離，此時再對此溶液進行檢測， 得到發(fā)光信號增大。在一定范圍內(nèi)赭曲霉毒素A的含量與發(fā)光信號的增大的數(shù)值相關(guān)，基 于此對赭曲霉毒素A標準品進行檢測，建立標準曲線，以達到對實際樣品中赭曲霉毒素A進 行定量檢測的目的；步驟為：
[0009] (1)通過高溫熱解法技術(shù)，制備似￥?4別。. 28644_上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒，并對其做表 面修飾。稱取一定量的YC13 ·6Η20,YbCl3 ·6Η20，ΕΚ：13αη:68· 54mol%Υ3+，28· 6mol%Yb3+， 2.86mol%Tm3+;總共lmmol)于三口燒瓶中，加入6mL油酸以及15mL1-十八稀。磁力攪拌 條件下，逐漸升高溫度至160°C，待混合液形成均一的溶液后，自然冷卻至室溫。準確稱取 〇.lg氫氧化鈉和〇. 1482g氟化銨，溶于10mL甲醇溶液混合均勻。將上述溶液緩慢加入到三 口燒瓶中，磁力攪拌30min后，緩慢蒸發(fā)甲醇，脫氣后，將混合液加熱至300°C，并且持續(xù)lh。 反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，離心收集材料，用環(huán)己烷和乙醇清洗三次，儲存?zhèn)溆谩?br>[0010] (2)利用配體交換法對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒進行表面羧基化修飾。取30mL二甘 醇，300mg聚丙烯酸（Mw= 2000)加入到三口燒瓶中，加熱至110°C，形成澄清透明溶液后， 緩慢加入lOOmg油酸包被的上轉(zhuǎn)換納米材料甲苯溶液，在氬氣保護下，110°C持續(xù)lh，升溫 至240°C持續(xù)2h，帶溶液冷卻至室溫后，加入乙醇沉淀材料，離心收集材料用乙醇和水清洗 三遍。
[0011] (3)采用兩步種子法制備金納米棒。金納米棒的制備分為兩步，第一步為金種 子溶液的制備，首先向7. 5mL0. 05M十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)溶液中加入0. 122mL 0. 0237M氯金酸溶液，搖勻后成深黃色，迅速向其中加入新鮮冰水配制的0. 6mL0. 01M硼氫 化鈉溶液，劇烈振蕩2min，溶液成淺棕色，反應(yīng)過程中有氣體跑出，注意放氣，最后將種子置 于40°C水浴中靜置2h后使用。第二步是金納米棒的生長，向試管中加入30mL0.05M十六 烷基三甲基溴化銨溶液，然后加入70μL0. 01M硝酸銀溶液和0. 735mL0. 0237M氯金酸溶 液，搖勻后，溶液呈亮黃色，再向其中加入0. 24mL0. 1M抗壞血酸溶液，輕輕搖勻，溶液由亮 黃色變?yōu)闊o色，此為生長溶液。最后加入〇.3mL用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)穩(wěn)定的金 種子溶液，輕輕振蕩lmin，靜置3h完成生長，得到長徑比為2. 5左右的金納米棒，橫向和縱 向等離子共振吸收峰分別為515nm和660nm左右，將制備好的金納米棒離心收集，用超純水 清洗三次，于4°C冰箱保存。
[0012] (4)利用EDC/NHS法將羧基化上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料與親和素（Avidin)偶聯(lián)。稱 取5mg聚丙烯酸修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料分散于5mLMES(pH5. 6)緩沖液中，超聲15min，加入 0. 6mL2mg/mLEDC溶液和0. 2mL2mg/mLNHS溶液，37°C搖床中活化2h。離心收集材料，用 10mM磷酸緩沖液清洗三次。然后分散于磷酸緩沖液中，加入lmL0.5mg/mL親和素溶液，在 37 °C搖床中反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后清洗數(shù)次，棄上清。
[0013] (5)利用通過親和素（Avidin)與生物素（Biotin)之間的特異性結(jié)合將表面修飾 親和素（Avidin)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒與生物素（Biotin)修飾的赭曲霉毒素A適配體 DNA單鏈連接。具體方法為：將親和素修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料分散于5mL磷酸緩沖液中，加 入一定量的生物素化赭曲霉毒素A適配體，在37°C搖床中孵育12h，離心收集材料和上清， 用磷酸緩沖液清洗三次，分散于BB緩沖液（10mMTris，pH8. 5，120mMNaCl，5mMKC1和20m