氯霉素半抗原和抗原的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法，具體涉及一種氯霉素半抗原和抗原 的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯霉素（Chloramphenicol，CAP)是一種對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌都有很好的抑 制作用的廉價(jià)高效廣譜抗生素，一度被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)中。但是動(dòng)物源性食品中殘留的 氯霉素隨著食物鏈被人體長(zhǎng)期攝入，可引發(fā)多種疾病。輕者破壞人體內(nèi)正常菌群的平衡狀 態(tài)，菌群失調(diào)，使人體產(chǎn)生耐藥菌珠，給今后患病使用抗生素治療帶來(lái)不良影響；抗生素過(guò) 敏體質(zhì)的人會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，危及健康。嚴(yán)重時(shí)可干擾骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并抑制幼稚 細(xì)胞DNA合成，導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，引發(fā)再生障礙性貧血、溶血、紫癜等惡性疾病。
[0003] 鑒于氯霉素的毒副作用，國(guó)際食品學(xué)界將其列為禁藥，歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī) 定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為"零容許量" (Zerotolerance)，即不得檢出，根據(jù)歐盟"2002/657/ EC"標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，動(dòng)物源性食物中氯霉素的最大要求檢出極限是0. 3 μ g/kg。不久美國(guó)FDA也 做出相應(yīng)的規(guī)定。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定了 CAP在所有食品動(dòng)物的可食用組織中不得檢出，并將 其從《中國(guó)獸藥典》中刪除，列為禁藥。并相應(yīng)制定了 SN0219-93和SCT3018-2004行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)，與國(guó)際接軌。
[0004] 氯霉素的檢測(cè)方法分為物理化學(xué)法和免疫化學(xué)法，前者有液相色譜法（LC)、高 效液相色譜法（HPLC)、質(zhì)譜法（MS)等，后者主要是酶免法（ELISA)，檢測(cè)的靈敏度均達(dá)到 ppb(yg/kg)級(jí)別。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又研發(fā)出液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS)、液相色 譜電噴霧電離質(zhì)譜法（LC-EITMS)、微生物分析等物理檢測(cè)新方法，對(duì)ELISA方法的應(yīng)用也 有了進(jìn)一步研究。
[0005] 量子點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定快速、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化 程度高、試劑穩(wěn)定且有效期長(zhǎng)出~18個(gè)月）等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)限比ELISA和理化檢測(cè)方法高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種氯霉素半抗原、抗原的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光 試劑盒中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的氯霉素半抗原，為式I所示的化合物；
[0008]
[0009] 本發(fā)明還公開了式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟：
[0010] ①10ml單口瓶中投入氯霉素原料藥323mg，5ml批陡溶解；
[0011] ②冰浴降溫至0-5度，分批加入對(duì)羧基苯磺酰氯230mg，1小時(shí)后升溫至室外，攪拌 反應(yīng)18小時(shí)；
[0012] ③TLC檢測(cè)，原料藥氯霉素反應(yīng)完全后處理，將反應(yīng)液傾倒入25ml冰水中，析出白 色沉淀，過(guò)濾，水洗濾餅，干燥得氯霉素半抗原450mg，mass檢測(cè)。
[0013] 本發(fā)明提供的氯霉素抗原，是將式I所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0014]常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白（KLH)等。
[0015] 所述式I所示化合物與BSA偶聯(lián)得到的氯霉素抗原的結(jié)構(gòu)見圖1。
[0016] 本發(fā)明還公開了所述氯霉素抗原制備的方法，包括如下步驟：
[0017] ①稱取 BSA50mg，溶解在 3. 5mlCB 液中，稱取半抗原 50/67000*60*507 = 22. 7mg 溶 解在 1. 5mlDMF 中，加入 NHS50/67000*120*115. 09 = 10. 3mg，EDC50/67000*120*191. 7 = 17. 2mg，室溫活化2小時(shí)；
[0018] ②冰浴下將活化液滴加到BSA的CB溶液中，4度反應(yīng)過(guò)夜，PBS透析。
[0019] 所述氯霉素抗原可以作為免疫原制備氯霉素特異性抗體，也可以作為包被原制備 量子點(diǎn)免疫熒光微孔板。
[0020] 應(yīng)用氯霉素抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0021 ] 所述氯霉素抗原、所述特異性抗體均可應(yīng)用于檢測(cè)氯霉素。
[0022] 本發(fā)明還公開了應(yīng)用氯霉素抗原和氯霉素特異性抗體制備得到的量子點(diǎn)免疫熒 光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括量子點(diǎn)標(biāo)記的所述抗體。
[0023] "量子點(diǎn)標(biāo)記的所述抗體"的制備方法具體如下：
[0024] ①取2. 5mg量子點(diǎn)，用ρΗ4· 7、0· 1M的MES緩沖液洗滌，然后用1ml ρΗ4· 7、0· 1M的 MES 緩沖液重懸，加入 0· 96mg EDC 和 1. 15mg NHS，37°C反應(yīng) 30 分鐘，20000rpm 離心 5min， 收集沉淀，即為活化后的量子點(diǎn)；
[0025] ②取步驟①得到的活化后的量子點(diǎn)，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將 2. 5mg活化后量子點(diǎn)、所述抗體（蛋白質(zhì)含量為0. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液混勻 (總體積為〇· 8ml)，25°C反應(yīng)3. 5小時(shí)；
[0026] ③取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質(zhì)量百分含量為5%，37°C反應(yīng)30分鐘， 20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液洗滌，用lml pH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液重懸；
[0027] ④取步驟③得到的液相，用ρΗ7· 4、0· 02M的PBS緩沖液稀釋至64000倍體積。
[0028] 本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有氯霉素中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計(jì)、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物制備針對(duì)小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，定量的檢測(cè)樣品中微量小分子目標(biāo)分 析物。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù) 中對(duì)氯霉素樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，以及在檢測(cè)過(guò)程中要用到精 密昂貴的檢測(cè)儀器而不適于推廣使用等缺點(diǎn)。本發(fā)明的氯霉素抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物可產(chǎn)生 了針對(duì)氯霉素的特異性抗體，用于快速檢測(cè)食品中的氯霉素殘留，具有操作簡(jiǎn)單、快速，處 理樣品量大，靈敏度高，特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為氯霉素抗原的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031] 圖2為氯霉素量子點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0033] 實(shí)施例1、氯霉素半抗原的制備
[0034] 氯霉素半抗原的制備方法，具體操作步驟包括：
[0035] 10ml單口瓶中投入氯霉素原料藥323mg，5ml吡啶溶解，冰浴降溫至0-5度，分批加 入對(duì)羧基苯磺酰氯230mg，1小時(shí)后升溫至室外，攪拌反應(yīng)18小時(shí)，TLC檢測(cè)，原料藥氯霉素 反應(yīng)完全后處理，將反應(yīng)液傾倒入25ml冰水中，析出白色沉淀，過(guò)濾，水洗濾餅，干燥得半 抗原450mg，mass檢測(cè)。
[0036] 半抗原的結(jié)構(gòu)式見式I :
[0037]
[0038] 實(shí)施例2、氯霉素人工抗原的制備
[0039] 一、氯霉素免疫抗原（CAP-BSA)的合成
[0040] ①稱取 BSA50mg，溶解在 3. 5mlCB 液中，稱取半抗原 50/67000*60*507 = 22. 7mg 溶 解在 1. 5mlDMF 中，加入 NHS50/67000*120*115. 09 = 10. 3mg，EDC50/67000*120*191. 7 = 17. 2mg，室溫活化2小時(shí)；
[0041] ②冰浴下將活化液滴加到BSA的CB溶液中，4 °C反應(yīng)過(guò)夜，PBS透析。
[0042] 免疫原的結(jié)構(gòu)式如下。
[0043]
[0044] 二、氯霉素包被抗原（CA