一種水泡性口炎病毒抗體快速檢測(cè)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)和病毒檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地涉及一種水泡性口炎病毒抗體 快速檢測(cè)試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 水泡性口炎（Vesicularstomatitis,VS)是由彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性 口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV)引起的人畜共患的重大動(dòng)物疫病。世界 動(dòng)物衛(wèi)生組織（0ΙΕ)將VS列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。目前，VSV分為兩個(gè)血清型，即印第安納 (Indiana,IN型）和新澤西（NewJersey,NJ型）。VSV的感染譜很廣，牛、豬、馬、羊和其它 多種野生動(dòng)物可感染，人也可以感染VSV，并出現(xiàn)急性熱性類似流感的癥狀。動(dòng)物感染VSV 發(fā)病后，臨床癥狀與口蹄疫（FMD)癥狀非常相似，很難根據(jù)臨床癥狀作鑒別診斷。水泡性口 炎嚴(yán)重影響反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及相關(guān)動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易，對(duì)疫區(qū)造成巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] VSV為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因全長(zhǎng)11163bp，共編碼5種主要病毒蛋白，包括糖蛋 白（G)、基質(zhì)蛋白（M)、核蛋白（N)、磷酸蛋白（NS)、病毒RNA聚合酶（L)。其中N蛋白由422 個(gè)氨基酸組成，呈現(xiàn)群特異性，為所有型的VSV所共有，誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和抗體，與其它彈狀 病毒無任何交叉反應(yīng)，因此VSVN蛋白是作為建立VSV抗體免疫學(xué)檢測(cè)方法的重要抗原。
[0004] 目前，可用于水泡性口炎病毒抗體檢測(cè)的方法有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID)和競(jìng)爭(zhēng) ELISA方法。由于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)特異性較差，需要時(shí)間長(zhǎng)等因素的制約，該方法在基層獸醫(yī) 部門很少應(yīng)用。競(jìng)爭(zhēng)ELISA具有較好的特異性和敏感性，可用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。但由于ELISA 檢測(cè)需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)操作人員，在條件較好的實(shí)驗(yàn)室才可以得到應(yīng)用。另外，目 前國(guó)內(nèi)沒有商品化的ELISA試劑盒。
[0005] 申請(qǐng)?zhí)枮?00910190437. 5的發(fā)明公開了 一種水泡性口炎病毒快速檢測(cè)試紙 條及其制作方法，但其是檢測(cè)水泡性口炎病毒，即檢測(cè)抗原，準(zhǔn)確性不高。申請(qǐng)?zhí)枮?200410008749. 7的發(fā)明公開了一種水泡性口炎病毒N基因重組表達(dá)質(zhì)粒載體、表達(dá)抗原以 及制備方法，該發(fā)明使用的是水泡性口炎病毒N蛋白全基因，蛋白表達(dá)量并不高。申請(qǐng)?zhí)枮?201010182429. 9的發(fā)明公開了一種水泡性口炎病毒抗體膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法， 該發(fā)明雖是檢測(cè)水泡性口炎病毒抗體，但使用抗原為VSV全病毒抗原，特異性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明公開了一種水泡性口炎病毒重組N蛋白 抗原及其制作方法。
[0007] 本發(fā)明公開了一種水泡性口炎病毒抗體快速檢測(cè)試紙條，其所述試紙條固定有水 泡性口炎病毒重組N蛋白抗原，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原的氨基酸序列為SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 進(jìn)一步地，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原，其基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
[0009] 所述試紙條包括背襯和硝酸纖維膜、金標(biāo)復(fù)合物墊、樣品墊、吸水墊，所述硝酸纖 維膜的上有檢測(cè)線，所述水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原墊是固定在檢測(cè)線上。
[0010] 進(jìn)一步地，所述檢測(cè)線，水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原的包被量為0. 175μg/ 條。
[0011] 進(jìn)一步地，所述硝酸纖維膜上還點(diǎn)有兔抗鏈球菌G蛋白IgG作為對(duì)照線。
[0012] 進(jìn)一步地，所述對(duì)照線，兔抗鏈球菌G蛋白IgG的包被量為0. 35μg/條。
[0013] 進(jìn)一步地，所述對(duì)照線與檢測(cè)線之間距離為5mm。
[0014] 進(jìn)一步地，所述試紙條為經(jīng)過切條機(jī)加工成70_X 3. 5mm的成品。
[0015] 本發(fā)明針對(duì)水泡性口炎水泡性口炎病毒N蛋白氨基酸序列，通過抗原表位分析和 密碼子優(yōu)化獲得截短并優(yōu)化后的VSVN基因序列，通過人工合成該序列并在原核表達(dá)體系 表達(dá)該基因，獲得水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原。相對(duì)于先有技術(shù)，本發(fā)明的水泡性口炎 病毒重組N蛋白抗原具有更好的抗原特性，且優(yōu)化后的基因序列在表達(dá)體系中蛋白表達(dá)量 尚，效果好。
[0016] 將本發(fā)明的水泡性口炎病毒重組N蛋白抗原應(yīng)用于制備快速檢測(cè)水泡性口炎病 毒抗體的試紙條，特異性好，靈敏度高，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)樣品量少，檢測(cè)成本 較低等優(yōu)點(diǎn)，為水泡性口炎病毒抗體檢測(cè)和水泡性口炎流行病學(xué)調(diào)查提供良好的檢測(cè)手 段。
[0017] 為了更好地理解和實(shí)施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0018] 圖1為SDS-PAGE (左圖）和Western-blot (右圖）分析基因表達(dá)的VSVN蛋白。其 中，Μ :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :轉(zhuǎn)化pET52/LIC質(zhì)粒的對(duì)照菌；2,4 :轉(zhuǎn)化pET52/LIC-mVSVN質(zhì)粒 的陽性菌（含密碼子優(yōu)化后的VSVN基因序列）；3, 5 :轉(zhuǎn)化pET52/LIC-VSVN質(zhì)粒的陽性菌 (含密碼子未優(yōu)化后的VSVN基因序列）。
[0019] 圖2為水泡性口炎病毒抗體快速檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。其中，
[0020] 1 :背襯，2 :硝酸纖維素膜，3 :樣品墊，4 :金標(biāo)復(fù)合物墊，5 :吸水墊，6 :檢測(cè)線，7 : 對(duì)照線。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1 :截短的VSVN蛋白的表達(dá)
[0023] 1、VSVN蛋白抗原表位分析和密碼子優(yōu)化：通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中VSVN基因序列 和對(duì)應(yīng)氨基酸序列（GenBank:J02428. 1)，利用在線軟件對(duì)其主要抗原表位進(jìn)行分析，確定 選擇抗原表位位于N蛋白中第88~374位氨基酸，其氨基酸序列為序列表中SEQIDNo. 1， 其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列（GenBank:J02428. 1)為第325~1185nt位核苷酸，見序列表SEQID No. 5〇
[0024] 2、VSVN基因密碼子優(yōu)化和人工合成：密碼子優(yōu)化，即根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)氨基酸密碼 子的偏愛性，對(duì)基因序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，將基因序列中利用率低或稀有的密碼子修改為表 達(dá)系統(tǒng)使用頻繁的密碼子，確保所表達(dá)蛋白的氨基酸序列不變。根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的 偏愛性，對(duì)選取的蛋白質(zhì)片段對(duì)應(yīng)的基因序列密碼子進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列標(biāo)記為 mVSVN，其序列為序列表中SEQIDNo. 2,通過人工合成該序列，將該序列克隆至pMD-18T載 體中。
[0025] 3、mVSVN基因引物設(shè)計(jì)：根據(jù)密碼子優(yōu)化后的VSVN基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，在 引物5'端人工添加LIC粘性末端，與商品化線性pET52/LIC末端互補(bǔ)的序列。PCR引物序 列如下，下劃線部分為L(zhǎng)IC粘性末端：
[0026] 上游引物（PI) ：5' ~CAGGGACCCGGTTGGTCAAGTTTCGGAATC~3,(SEQIDNo. 3)；
[0027] 下游引物（P2) :5,-GGCACCAGAGCGTTATCACGACCTTGTGGTGG-3'（SEQIDNo. 4);
[0028] 4、PCR擴(kuò)增mVSVN基因：用PCR擴(kuò)增試劑盒（Takara公司產(chǎn)品），從pMD-18T-mVSVN 質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因片段。在PCR管中加入以下組分：
[0029]
[0030] 將上述組分混合后置于PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min;95°C lmin，55°Clmin，72°Clmin，35個(gè)循環(huán)，72°ClOmin。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物約為890bp，用DNA快速回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
[0031] 5、pET52/LIC-mVSVN重組表達(dá)載體的構(gòu)建：用T4DNA聚合酶處理的上述PCR產(chǎn)物 與商品化線性pET52/LIc載體（Invitrogen公司產(chǎn)品）連接，利用T4DNA聚合酶外切酶活 性，切去3'端約11~12個(gè)堿基，即形成與LIC位點(diǎn)序列互補(bǔ)的粘性末端，處理后的PCR產(chǎn) 物可與線性PET52/LIC定向連接。反應(yīng)體系如下：
[0032]
[0033] 將上述反應(yīng)物混合后，于22°C反應(yīng)30min，然后于75°C反應(yīng)20min。在1. 5mL離心 管中，加入線性PET52/LIC質(zhì)粒1μL、經(jīng)T4DNA聚合酶處理的PCR產(chǎn)物2μL和25mmol/L EDTAlyL，混合后，于22°C反應(yīng)5min。取上述反應(yīng)物lyL轉(zhuǎn)化100yLNovaBlueE.coli 感受態(tài)細(xì)胞（Invitrogen公司產(chǎn)品），冰浴5min，42°C熱激30s，冰浴2min。加入300μL S0C液體培養(yǎng)基，37°C震蕩（200r/min)培養(yǎng)lh后，5,000r/min離心5min，棄去350yL上 清，用加樣器吹打數(shù)次，重懸菌體后涂布含Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，37°C培養(yǎng) 16h后，隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落，分別接種至3mL含Ampicillin(50μg/mL)的LB培養(yǎng)液中， 37°C震蕩培養(yǎng)過夜。取1. 5mL培養(yǎng)物，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒（TARAKA公司產(chǎn)品）提取質(zhì) 粒DNA，用該DNA作為模板，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系如下：
[0034]
[0035] 反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 5min;95°Clmin，54°Clmin，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)， 72°C10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8yLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。同時(shí)將pET52/LIC-mVSVN 質(zhì)粒DNA送到TAKARA公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，經(jīng)測(cè)定，其序列為序列表中SEQIDNo. 2完 全一致。
[0036] 6、VSVN蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)及分析：將上述經(jīng)鑒定的pET52-VSVN質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化（DE3)pLacIE.coli感受態(tài)細(xì)胞（Invitrogen公司產(chǎn)品），涂于含Ampicillin(50μg/ mL)的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12~16h，挑取陽性單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，于37°C 震蕩培養(yǎng)2h后，加入IPTG(終濃度為lmmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)VSVN蛋白。收集上述菌液， 5000r/min離心10min，取上清，加入原體積約1/10的PBS(pH7. 2)，用超聲波破碎儀對(duì)菌體 進(jìn)行破碎處理。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)產(chǎn)物大小約為36Ku(圖1)。由圖1可看出SDS-PAGE 試驗(yàn)表明經(jīng)過優(yōu)化后，VSVN蛋白表達(dá)量明顯提高。用羊抗VSV陽性血清和HRP標(biāo)記的兔抗 羊IgG(SIGMA公司產(chǎn)品）進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物可以和抗VSV陽性血 清反應(yīng)。
[0037] 7、VSVN蛋白的純化：使用6XHis標(biāo)簽融合蛋白純化試劑盒對(duì)表達(dá)VSVN表達(dá)產(chǎn)物 進(jìn)行純