0μg/mL、0. 20μg/mL、0. 50μg/mL、1. 0μg/mL、2. 0μg/mL、5. 0μg/血。于冰箱-20°c保 存。W標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[003引S、樣品處理
[0034] (1)皂化：稱(chēng)取混合均勻的試樣10.Og，依次加入1. 5g抗壞血酸、1.Og焦性沒(méi)食子 酸、0.Ig2, 6-二叔下基對(duì)甲酪、100血無(wú)水乙醇、30%氨氧化鐘水溶液100血，于80°C加熱 磁力攬拌器上冷凝回流35分鐘，取出后迅速冷卻至室溫。
[0035] (2)萃?。簩⒃砘恨D(zhuǎn)移至500血分液漏斗中，加入100血石油酸萃取，邊搖邊排 氣，搖動(dòng)10分鐘，靜置，將皂化液轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗后重復(fù)上述萃取3次。合并3次萃取 所得石油酸，過(guò)無(wú)水硫酸鋼脫去痕量水，圓底燒瓶收集后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45°C蒸至近干，取 出后于氮吹儀吹干。
[003引做定容：將吹干的圓底燒瓶用正己燒分多次少量的洗涂并轉(zhuǎn)移定容至lOmL容量 瓶中待用。
[0037] (4)凈化：硅膠柱依次用二氯甲燒和正己燒淋洗活化后，吸取定容后的樣液 1. 0血轉(zhuǎn)移到硅膠柱中，再依次用5血正己燒，5血環(huán)己燒：正己燒（1:1)(按體積加入0. 8% 異丙醇）溶液淋洗除雜并棄去后加5mL乙酸乙醋：正己燒（40:60)混合溶液洗脫并收集，氮 氣吹干，加入1. 0血甲醇溶解，0. 22μm濾膜過(guò)濾，待UPLC測(cè)定。
[00測(cè)妨色譜條件
[0039]色譜柱：WatersACQUITYIPLCB邸C18 柱（1. 7μL?，2.ImmX100mm);流動(dòng)相：甲 醇+水巧5+5);流速0. 3血/min;柱溫：40°C;二極管陣列檢測(cè)器（PDA)檢測(cè)波長(zhǎng)：264皿；進(jìn) 樣量為5μL。
[0040] 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[00川 （1)樣品處理：經(jīng)試驗(yàn)，10%、20%、30%、40%、50%的氨氧化鐘水溶液皂化效果， 發(fā)現(xiàn)在保健食品檢測(cè)中30%氨氧化鐘水溶液即可皂化完全。在皂化溫度方面試驗(yàn)50°C、 60°C、70°C、80°C、90°C的皂化效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)皂化溫度為80°C，皂化35分鐘即可皂化完全，且 被測(cè)物質(zhì)不被破壞，低于此溫度時(shí)需要延長(zhǎng)皂化時(shí)間，高于此溫度容易使待測(cè)物質(zhì)氧化。 [004引似樣品凈化
[0043] 吸取定容后的樣液分別試驗(yàn)5血正己燒收集、5血環(huán)己燒：正己燒1:1 (按體積加 入0. 8%異丙醇）溶液收集，發(fā)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)均不在兩種收集液中，故選用運(yùn)兩種試劑作為上 樣后的除雜。
[0044] 吸取定容后的樣液上柱，分別試驗(yàn)乙酸乙醋與正己燒混合溶液百分比例為10:90、 20:80、30:70、40:60、50:50、60:40作為洗脫液收集，分別測(cè)定并繪制洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。
[004引由圖1可知，當(dāng)乙酸乙醋與正己燒體積比例為40:60時(shí)，洗脫率最高，故選擇乙酸 乙醋：正己燒（40:60)作為洗脫液。
[0046] (3)線(xiàn)性范圍及檢出限
[0047]避光條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為 0. 10μg/mL、0. 20μg/mL、0. 50μg/mL、l. 0μg/ 血、2. 0μg/mL、5. 0μg/血。進(jìn)樣5μL，記錄色譜圖和峰面積，線(xiàn)性回歸方程為y= 46152X-1735. 1，相關(guān)系數(shù)為0. 9996。按取樣10.Og最后定容至10血計(jì)算，方法檢出限為 l.Oyg/lOOg。標(biāo)準(zhǔn)圖譜見(jiàn)圖2。
[0048] (4)加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)
[0049] 采用樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品方式，在Ξ個(gè)濃度水平進(jìn)行添加，按上述樣品處理操作步驟 在不同時(shí)間進(jìn)行6次試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，當(dāng)添加水平為0. 20~1.Omg/kg時(shí)，本方法的加 標(biāo)回收率為87. 8~105. 8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1. 28~3. 58,樣品圖譜見(jiàn)圖3,樣品加標(biāo)圖譜 見(jiàn)圖4。
[0050] 表1空白樣品回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果-FLD檢測(cè)器
[0051]
[0052
[0053] 本方法采用固相萃取-超高效液相色譜SPE-UPLC-PDA法檢測(cè)保健食品中維生素 D3含量，改變傳統(tǒng)高效液相色譜HPLC法需要正相-反相雙系統(tǒng)操作的方法，改善了前處理 時(shí)間長(zhǎng)、有效成分易破壞、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器數(shù)量要求多等問(wèn)題，使得 維生素化在經(jīng)皂化、萃取、定容后直接過(guò)固相萃取柱凈化，進(jìn)反相UPLC-PDA液相系統(tǒng)上樣， 5分鐘內(nèi)出峰，極大的縮短了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)的效率。
[0054]另外，通過(guò)改變?cè)砘瘻囟群驮砘瘯r(shí)間，使得樣品能夠皂化充分，減少雜質(zhì)干擾、提 高實(shí)驗(yàn)的回收率。
[00巧]因此，用本方法測(cè)定能夠滿(mǎn)足實(shí)際工作需要，填補(bǔ)了保健食品中維生素化含量標(biāo) 準(zhǔn)方法的空白，是測(cè)定保健食品中維生素化含量的高效、有效的定量方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取待測(cè)樣品，經(jīng)皂化、萃取后，獲得預(yù)處理樣液； (2) 采用硅膠柱固相萃取凈化技術(shù)，對(duì)預(yù)處理樣液進(jìn)行凈化，獲得待測(cè)樣液； (3) 利用超高效液相色譜技術(shù)對(duì)待測(cè)樣液中的維生素％進(jìn)行鑒定，獲得保健食品中維 生素〇3的含量。2. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，步驟 (1) 中，所述皂化的溫度為80°C，時(shí)間為35min。3. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，皂化 過(guò)程中，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鉀水溶液作為皂化液處理待測(cè)樣品。4. 如權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，皂化 過(guò)程中，向待測(cè)樣品中同時(shí)加入抗壞血酸、焦性沒(méi)食子酸和2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚。5. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，萃取 過(guò)程中，萃取劑為石油醚。6. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，步驟 (2) 中，采用二氯甲烷和正己烷淋洗活化硅膠柱，加入所述預(yù)處理樣液后，依次用正己烷、體 積比為1:1的環(huán)己烷：正己烷溶液淋洗硅膠柱去除雜質(zhì)。7. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，步驟 (2) 中，采用體積百分比為40:60的乙酸乙酯：正己烷溶液作為洗脫液。8. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，其特征在于，步驟 (3) 中，色譜的條件為：色譜柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18柱（1. 7μπι, 2.ImmX100mm); 流動(dòng)相：甲醇+水（95+5);流速0.3mL/min;柱溫：40°C;二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)： 264nm;進(jìn)樣量為5yL。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)保健食品中維生素D3含量的方法，該方法包括以下步驟：取待測(cè)樣品，經(jīng)皂化、萃取后，獲得預(yù)處理樣液；采用硅膠柱固相萃取凈化技術(shù)，對(duì)預(yù)處理樣液進(jìn)行凈化，獲得待測(cè)樣液；利用超高效液相色譜技術(shù)對(duì)待測(cè)樣液中的維生素D3進(jìn)行鑒定，獲得保健食品中維生素D3的含量。本發(fā)明采用固相萃取-超高效液相色譜法，改變傳統(tǒng)高效液相色譜法需要正相-反相雙系統(tǒng)操作的方法，解決了前處理時(shí)間長(zhǎng)、有效成分易破壞、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器數(shù)量要求多等問(wèn)題，使維生素D3經(jīng)預(yù)處理后，直接過(guò)固相萃取柱凈化，進(jìn)反相液相系統(tǒng)上樣，快速出峰，極大地縮短了時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
【IPC分類(lèi)】G01N30/02, G01N30/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105403631
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510712065
【發(fā)明人】王天嬌, 吳平谷, 胡爭(zhēng)艷, 王立媛
【申請(qǐng)人】浙江省疾病預(yù)防控制中心
【公開(kāi)日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月28日