懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色方法及染色裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種對(duì)測(cè)試用樣品著色的方法，具體涉及一種懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色方法及染色裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫熒光染色技術(shù)是常用細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，它應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)原理，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位，用于觀察目的蛋白的表達(dá)以及蛋白間是否存在共定位或共表達(dá)關(guān)系。
[0003]對(duì)于多見的貼壁細(xì)胞免疫熒光染色，常用且普遍采用的是使細(xì)胞“爬片”于多聚賴氨酸包被的載體表面，然后進(jìn)行經(jīng)典的染色操作。然而對(duì)于在干細(xì)胞研究中常用的懸浮細(xì)胞球，因?yàn)樗毁N壁，所以在經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)操作過程中極易造成細(xì)胞球的丟失。盡管現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道使用多聚賴氨酸包被的蓋玻片即可將懸浮細(xì)胞球粘附于蓋玻片[卜3]，但實(shí)際操作結(jié)果并非如此，即使使用多聚賴氨酸包被的蓋玻片，仍僅有10%~20%細(xì)胞球會(huì)粘附于蓋玻片表面，且其中95%以上的細(xì)胞球會(huì)在經(jīng)典操作過程中丟失，最終導(dǎo)致樣本量過少而實(shí)驗(yàn)失敗。
[0004]針對(duì)懸浮細(xì)胞的不貼壁性，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了多種可用于懸浮細(xì)胞球的免疫熒光染色方法。
[0005]中國專利文獻(xiàn)CN102288471B公開了一種懸浮細(xì)胞的免疫熒光染色方法，該方法適用于懸浮細(xì)胞，完成實(shí)驗(yàn)至少需要10次以上細(xì)胞離心，此種方法不僅耗費(fèi)時(shí)間和人力，而且將此種方法應(yīng)用于懸浮細(xì)胞球時(shí)，由于細(xì)胞球的內(nèi)層細(xì)胞和外層細(xì)胞表型不同，多次離心可使外層細(xì)胞脫離，損壞細(xì)胞球的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成，致最終檢測(cè)的細(xì)胞球構(gòu)成與實(shí)驗(yàn)操作前不同，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0006]還有文獻(xiàn)報(bào)道用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h~4h可有助于細(xì)胞球粘附于蓋玻片[1'2^6]。此種方法雖然克服了細(xì)胞球的不貼壁性，但細(xì)胞球需要在無血清條件下培養(yǎng)才能維持其表型，有血清培養(yǎng)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞球細(xì)胞分化m，改變其表型，干擾最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。且根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，細(xì)胞球于10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30分鐘即出現(xiàn)明顯形態(tài)變化，細(xì)胞球外層細(xì)胞脫離細(xì)胞球并貼壁，說明細(xì)胞球已經(jīng)發(fā)生表型改變，細(xì)胞組成由于有血清培養(yǎng)而被破壞。
[0007]Geraldo, S.等人研究發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞球固定于膠原蛋白凝膠中確實(shí)可以保證細(xì)胞球不丟失M，但此種方法仍然存在缺陷:首先，凝膠中的膠原蛋白纖維會(huì)起到遮擋作用，影響共聚焦顯微鏡的激發(fā)光強(qiáng)度和穿透距離；其次，為了達(dá)到同樣的染色效果，染色過程中需要抗體工作液濃度加倍甚至三倍，并延長抗體孵育時(shí)間，增加了消耗的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)M。
[0008]Guerrero-Cazares, Η.等人研究將細(xì)胞球應(yīng)用OCT包埋劑包埋制成冰凍組織切片再行免疫熒光染色[1°]，此種方法的缺點(diǎn)在于需要冰凍切片機(jī)，冰凍組織的切片需要具備專業(yè)技術(shù)的人員制備，且切片的過程中難以找到有細(xì)胞球的層面針對(duì)性取材，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間很長。
[0009]參考文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的懸浮細(xì)胞球不貼壁生長難以制樣以及現(xiàn)有懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色方法存在的各種缺點(diǎn)而提出的，其目的是提供一種懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色方法及染色裝置。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色方法，所述染色方法包括以下步驟:
(i)組合細(xì)胞小室和染色套件，取細(xì)胞球懸液加入細(xì)胞小室，棄染色套件內(nèi)培養(yǎng)基，清洗細(xì)胞球；
(ii)向細(xì)胞小室中加入組織細(xì)胞固定液固定，棄染色套件內(nèi)液體，清洗細(xì)胞球；
(iii)向細(xì)胞小室中加入TritonX-100通透細(xì)胞，棄染色套件內(nèi)液體，清洗細(xì)胞球；
(iv)向細(xì)胞小室中加入封閉液封閉，孵育，棄染色套件內(nèi)液體；
(v)向細(xì)胞小室中加入抗目的蛋白的一抗工作液，孵育，恢復(fù)至室溫，回收染色套件內(nèi)一抗工作液，清洗細(xì)胞球； (vi)向細(xì)胞小室中加入抗一抗的熒光二抗工作液，孵育，棄染色套件(2)內(nèi)液體，清洗細(xì)胞球；
(vii)向細(xì)胞小室中加入DAPI染液染色細(xì)胞核，棄染色套件內(nèi)液體，清洗細(xì)胞球。
[0012]所述清洗細(xì)胞球的方法為重組細(xì)胞小室和染色套件，向細(xì)胞小室中加入200ulPBS清洗細(xì)胞球，靜置5min，拔下染色套件，棄染色套件內(nèi)PBS，重復(fù)操作三次。
[0013]所述步驟(vii)完成染色后，重組細(xì)胞小室和染色套件，向細(xì)胞小室中加入150ulPBS，置于濕盒中4 °C避光保存。
[0014]所述步驟(ii)中組織細(xì)胞固定液為多聚甲醛，多聚甲醛的加入量為lOOul，其質(zhì)量濃度為4%，多聚甲醛固定時(shí)間為lOmin。
[0015]所述步驟(iii)中Triton X-100的加入量為lOOul，其質(zhì)量濃度為0.2%,TritonX-100通透細(xì)胞的時(shí)間為lOmin。
[0016]所述步驟(iv)中封閉液為山羊血清，山羊血清的加入量為lOOul，其質(zhì)量濃度為
2% ο
[0017]所述步驟(vi)中抗一抗的熒光二抗工作液的加入量為lOOul。
[0018]所述步驟(vii)DAPI染液的加入量為100ul，DAPI染液染色細(xì)胞核的時(shí)間為5min。
[0019]所述步驟(iv)中孵育的方法為置于濕盒中于37°C下孵育lh ;所述步驟(V)中孵育的方法為置于濕盒中4°C孵育過夜；所述步驟(vi)中孵育的方法為于濕盒中37°C避光孵育2ho
[0020]一種懸浮細(xì)胞球免疫熒光染色裝置，包括細(xì)胞小室，所述細(xì)胞小室為上端敞口的圓臺(tái)型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞小室的底面為有機(jī)材料膜，還包括套裝于細(xì)胞小室下端外部的染色套件，染色套件是中空且上端敞口的圓臺(tái)型結(jié)構(gòu)，中部形成內(nèi)底，內(nèi)底為下陷的圓錐面。
[0021]本發(fā)明的有益效果是: