一種分離富集測定水環(huán)境中12種殘留藥物的方法
【專利說明】一種分離富集測定水環(huán)境中12種殘留藥物的方法 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分離富集測定水環(huán)境中衡量殘留藥物的檢測方法，特別地提供一 種新的樣品前處理方式和靈敏的檢測方式，具體來說是樣品前處理技術結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術 直接測定水樣中12種常用藥物的含量，屬于水環(huán)境中微量有機污染物質(zhì)殘留安全檢測領 域。 【【背景技術】】
[0002] 抗生素主要是由細菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或人工合成的類似 物，主要用于治療各種細菌感染或致病微生物感染類疾病，為人類健康事業(yè)作出了巨大貢 獻。但是，近年來抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴重，衛(wèi)生部曾表示，在中國，患者抗生素的使用率達 到70%，是歐美國家的兩倍，但真正需要使用的不到20%。此外，抗生素的濫用除了體現(xiàn)在 醫(yī)藥行業(yè)外，也體現(xiàn)在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及工業(yè)上。
[0003] 非留體抗炎藥是一類不含有留體結(jié)構(gòu)的抗炎藥具有抗炎、抗風濕、止痛、退熱和抗 凝血等作用，在臨床上廣泛用于骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、多種發(fā)熱和各種疼痛癥狀的緩 解。目前非留體抗炎藥是全球使用最多的藥物種類之一。全世界大約每天有3000萬人在 使用。
[0004] 抗生素和非留體抗炎藥的濫用給我國地表水造成了嚴重的污染。有報道稱，已有 68種抗生素在我國的地表水環(huán)境中被檢出，而且被檢出抗生素的總體濃度水平與檢出頻率 均較高，其中一些抗生素在珠江、黃浦江等地的檢出頻率高達100%，有些抗生素檢出的濃 度高達每升幾百納克，工業(yè)發(fā)達的國家則小于20納克。這些在水環(huán)境中長期存在的抗生素 會誘導微生物的耐藥性，并最終通過食物鏈對人類健康構(gòu)成潛在威脅，控制水環(huán)境中的抗 生素已刻不容緩。
[0005] 樣品的前處理是關系到分析結(jié)果準確性的關鍵步驟，有調(diào)查顯示在整個色譜分析 過程中，30%的誤差來源于樣品前處理。由此可見，要保證分析結(jié)果的準確性，必須從樣品 前處理技術入手。隨著人們對于水環(huán)境中抗生素問題的日益重視，有關水環(huán)境中藥物殘留 檢測的專利和論文已有公開發(fā)表。例如中國專利公開號CN101639466A公開了一種測定水 環(huán)境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中國專利公開號CN101696964A公開了一種針對水 環(huán)境中氟喹諾酮的SPE-HPLC-熒光方法；中國專利公開號CN103336080A公開了一種測定水 環(huán)境中四環(huán)素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中國專利公開號CN103278587A公開了一種針對水 環(huán)境中頭孢的HLB-HPLC-MS方法等，這些方法的前處理方式主要是以固相萃取為主。水環(huán) 境中物染污物的種類多，存在形態(tài)各異，濃度較低而且環(huán)境基質(zhì)比較復雜，采取固相萃取為 前處理方式，可以去除不需要的雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應。但是，經(jīng)固相萃取后，樣品中待測物的 濃度在一定程度上會被稀釋，這在一定程度上限制了其使用。
[0006] 超聲輔助分散液液微萃?。║A-DLLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前 處理方法，具有操作簡單，有機試劑用量少，富集倍數(shù)大等優(yōu)點，操作簡單、快速，污染少等 優(yōu)點。
[0007] 隨著水安全標準的日益提高，對于能夠快速、靈敏、準確地測定水源中盡可能多的 抗生素殘留存在迫切需要，也是目前水環(huán)境領域中深入研究的重點課題之一。超高效液相 色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS)是21世紀初發(fā)展起來的一種分析技術，它是一種結(jié)合了UPLC 的高效分離能力與MS/MS的高靈敏度和極強專屬性的分離檢測技術，具有應用范圍廣、分 離能力強、靈敏度高、分析速度快和自動化程度高等特點，目前已成為有機物分析，特別是 藥物分析的重要方法之一。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種同時測定水環(huán)境（飲用水、自來 水、河水、污水處理廠進出水）中12種藥物的方法。本發(fā)明采用超聲輔助分散液液微萃取 作為水環(huán)境樣品的前處理技術，并利用超高液相色譜-質(zhì)譜連用為檢測器，克服了現(xiàn)有方 法有機試劑消耗大、干擾多以及檢測限等問題，能夠快速檢測水環(huán)境中酮洛芬、環(huán)丙沙星、 替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲惡唑、氯霉素、頭孢呋辛酯、吡羅昔康、 甲芬那酸12種藥物的含量，適用對象廣，測定結(jié)果靈敏，準確，干擾少。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0010] -種分離富集并同時檢測水環(huán)境中12種藥物的方法，其具體步驟如下：
[0011] 超聲輔助分散液液微萃取的條件的優(yōu)化
[0012] 選擇環(huán)境中常見的藥物（酮洛芬、環(huán)丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林 酸、萘普生、磺胺甲惡唑、氯霉素、頭孢呋辛酯、吡羅昔康、甲芬那酸），采用單因素試驗，對 UA-DLLME水中殘留藥物提取進行條件考察，包括萃取溶劑的種類和體積、分散劑的種類和 體積、渦旋時間和超聲時間等，選擇最優(yōu)的條件，得到在最優(yōu)條件下對抗生素的最大萃取 率；
[0013] 本發(fā)明包括如下步驟：
[0014] (1)水樣的預處理
[0015] 采集、過濾后的水樣用0· 1-0. 3mol/LHC1調(diào)至pH3. 0-4. 0,移取至12mL玻璃離心 管內(nèi)；
[0016] (2)超聲輔助分散液液微萃?。║A-DLLME)富集濃縮過程
[0017] 將步驟⑴得到的樣品中分別加入二氯甲烷和體積比為2:1-1:2的分散劑甲 醇-乙腈，渦旋，超聲，離心，去除上層水，下層有機相用氮氣吹干，得殘渣備用。
[0018] (3)超高液相-質(zhì)譜連用測定水環(huán)境中12種藥物
[0019] 超高液相色譜分離
[0020] 有機相為乙腈（B)，水相為體積比為0. 05-0. 3%的甲酸水溶液（A)，采取梯度洗脫 程序，其梯度程序為 〇_4min:35% -65%B;4-5min:65%B;5-7min，65% -35%B;流速為 0· 2-0. 4mL·min\ 柱溫為 30-35 °C，
[0021] 質(zhì)譜檢測
[0022] 離子源為電噴霧離子化源（ESI源），源溫度為120°C，毛細管電壓為3kV，脫溶劑 氣溫度：350°C，脫溶劑氣流速為700L/hr，掃描時間：0.ls，檢測方式選擇多反應離子檢測 (MRM)；
[0023] 精密量取乙腈-水（2:1-1:2)溶液100μL溶解步驟（2)中的殘渣，渦旋后，用 0. 22μm濾膜過濾，得供試品，進樣量5μL。
[0024] 其中，步驟（1)中水樣用量為：5ml
[0025] 步驟⑵中二氯甲燒、甲醇-乙腈的用量分別為：800μ1，1200μ1
[0026] 禍旋時間：l_5min超聲時間：5_10min離心轉(zhuǎn)速：4000-10000rpm離心時間： 5_15min
[0027] 具體地，本發(fā)明可以采用如下方法制備：
[0028] (1)水樣的預處理
[0029] 水樣采集后封裝冷凍，臨用前解凍，過濾，其過濾方式為依次經(jīng)定量濾紙雙層過濾 1-4遍，0. 45μm濾膜過濾1-3遍；定量取過濾后的水樣5ml,用0. 1-0. 3mol/L酸調(diào)至pH 3. 0-4. 0,移取至12mL玻璃離心管內(nèi)；
[0030] (2)超聲輔助分散液液微萃?。║A-DLLME)富集濃縮過程
[0031] 將步驟（1)中得到的樣品中分別加入一定萃取劑二氯甲烷800μL和體積比為2: 1-1 :2的分散劑甲醇-乙腈1200μL，渦旋l-5min，超聲5-10min，在4000-10000rpm下離心 lOmin，去除上層水，下層有機相在35-40°C水浴條件下，用氮氣吹干，得殘渣備用。
[0032] (3)超高液相-質(zhì)譜連用測定水環(huán)境中12種藥物
[0033] (3. 1)超高液相色譜分離
[0034] 有機相為乙腈（B)，水相為體積比為0. 05-0. 3%的甲酸水溶液（A)，采取梯度洗脫 程序，其梯度程序為 〇_4min:35% -65%B;4-5min:65%B;5-7min，65% -35%B;流速為 0· 2-0. 4mL·min\ 柱溫為 30-35 °C，
[0035] 表1.梯度洗脫程序
[0036]
[0037] (3. 2)質(zhì)譜檢測
[0038] 離子源為電噴霧離子化源（ESI源），源溫度為120°C，毛細管電壓為3kV，脫溶 劑氣溫度：350°C，脫溶劑氣流速700L/hr，掃描時間：0.ls，檢測方式選擇多反應離子檢測 (MRM)；
[0039] (3. 3)精密量取乙腈-水（2:1-1:2)溶液100μL溶解步驟⑵中的殘渣，渦旋后， 用0· 22μm濾膜過濾，得供試品，進樣量5μL;
[0040] (4) 12種藥物含量測定結(jié)果的計算
[0041] 本方法將超聲應用于超聲輔助分散液液微萃取，即UA-DLLME，可以利用DLLME來 富集待測物，同時利用超聲來提高提取效率，大大增加了富集倍數(shù)，簡化了樣品前處理的步 驟。本課題構(gòu)建的超聲輔助-分散液液微萃取前處理方法為前處理技術的開發(fā)應用提供了 新思路，也為對環(huán)境中痕量藥物殘留的提取、濃縮與分離增加了新方法。
[0042] 本方法將超聲的防御和分散液液微萃取聯(lián)用既簡化了樣品前處理的步驟，也大大 增加了富集倍數(shù)，為前處理技術的開發(fā)應用提供了新思路，也為對環(huán)境中痕量藥物殘留的 提取、濃縮與分離增加了新方法。本方法以超高液相-質(zhì)譜連用儀為檢測定量工具，同時測 定了水環(huán)境（飲用水、自來水、河水、污水處理廠進出水）中12種藥物，與普通的檢測方式 相比，實現(xiàn)了對藥物的高提取效率和高靈敏度的有效結(jié)合，且具有分析速度快、使用范圍廣 等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0043] 圖1.樣品pH對12種藥物回收率的影響
[0044] 圖2.萃取劑種類對12種藥物回收率的影響；
[0045] 圖3.萃取劑用量對12種藥物回收率的影響；
[0046] 圖4.分散劑種類對12種藥物回收率的影響；
[0047] 圖5.分散劑用量對12種藥物回收率的影響。
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