一種檢測伏馬毒素免疫親和凝膠檢測柱及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于小分子化合物免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及免疫化學(xué)、酶學(xué)與分析化學(xué)技術(shù)等，尤其是涉及一種伏馬毒素免疫親和凝膠可視化檢測柱的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]伏馬毒素(Fumonisins, FBs)是霉菌毒素之一，是由串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme She Id)在特定的溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物，多見于糧食和飼料中。其結(jié)構(gòu)中含有一類不同的多氫醇和丙三羧酸，使其具有生物毒性，且對(duì)熱很穩(wěn)定，在多數(shù)糧食加工處理過程中均比較穩(wěn)定，因此其經(jīng)過糧食飼料的加工生產(chǎn)等過程后仍可以保持其毒性，對(duì)人類及畜牧業(yè)危害較大。其在人畜體內(nèi)的作用比較復(fù)雜，可以抑制N-脂?；窠?jīng)鞘氨醇合成酶的合成，從而阻斷神經(jīng)鞘氨醇(Sphinngosine, SO)合成，破壞鞘脂類的代謝或影響鞘脂類的功能，這一抑制可引起二氫神經(jīng)鞘氨醇(Shpinganine, SA)升高，導(dǎo)致組織、血、尿中SA/S0比值的升高。而細(xì)胞內(nèi)自由SA的聚集是有毒性的，其量的平衡與否直接決定了細(xì)胞能否存活。1993年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)研究結(jié)果為(The Internat1nal Agencyfor Research on Caner)伏馬毒素定位2B級(jí)致癌物質(zhì)(可能是人類致癌物)，其可以引起人畜的中毒，由于人畜有種屬和器官的不同，伏馬毒素對(duì)不同種屬的會(huì)引起其不同的病理反應(yīng)，目前已知的病癥主要有馬腦白質(zhì)軟化癥(Equine Leucoencephalomalacia ELEM)，豬的肺水腫(Pig Pulmonary Edema，PPE)，大鼠肝中毒及肝癌，還可以引起人類食道癌(HumanEsophageal Cancer, HEC),雞的免疫系統(tǒng)紊亂及致死性疾病，狒狒的心血管病變以及羊類腎病變等。因此，為了保障人民健康必須建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單快速測定方法對(duì)伏馬毒素殘留進(jìn)行監(jiān)控。
[0003]目前報(bào)到的伏馬毒素檢測方法主要有:薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、免疫學(xué)檢測方法等。高效液相色譜(HPLC)法準(zhǔn)確度高，而且是目前應(yīng)用最多的檢測方法，但該方法存在一些缺點(diǎn)，如所需儀器既多又昂貴，且需專業(yè)人員進(jìn)行操作，樣品處理步驟繁鎖，需要衍生，回收率低等問題，所以不適合廣泛的推廣使用。可視化快速免疫檢測技術(shù)，像試紙條、凝膠檢測柱等，是相對(duì)獨(dú)立的快速檢測方法。不需任何儀器設(shè)備，分析過程特別是前處理的步驟大大簡化了，幾分鐘就可用肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，非常適合于大量樣品的現(xiàn)場篩查和基層推廣。因此該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。本論文借鑒凝膠柱免疫檢測技術(shù)，為某些顏色較深及基質(zhì)影響較大的樣品中的伏馬毒素殘留檢測分析，提供一種行之有效的可視化定性半定量快速簡單檢測方法，為食品安全的有力監(jiān)管提供可靠的技術(shù)保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提出一種可以定性半定量的檢測食品中的伏馬毒素的簡單、省時(shí)、靈敏的可視化免疫親和凝膠檢測柱的制備。只要樣品中含有酶標(biāo)記抗原，凝膠檢測柱的質(zhì)控層就會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，它可以確保檢測柱可以正常檢測，達(dá)到質(zhì)控的作用。以凝膠檢測柱的質(zhì)控層為基準(zhǔn)，通過檢測層顏色深淺變化達(dá)到定性或半定量檢測食品樣品中的伏馬毒素的目的。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]封閉膠的制備
[0007](1)溶脹:稱取1.00g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到80mL的配制好的HC1溶液中，攪拌溶脹lOmin (溶脹后膠的終體積約為3.5mL)。
[0008](2)淋洗:將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到在具砂板層析柱中，再加入200mL HC1淋洗，然后用偶聯(lián)緩沖液沖洗柱子，調(diào)節(jié)柱子pH至中性。
[0009](3)封閉:加入9mL甘氨酸封閉液，密封柱子，室溫下震蕩反應(yīng)2h。
[0010](4)清洗:首先加入10mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗一次，然后用10mL的醋酸鈉緩沖溶液和10mL的偶聯(lián)緩沖液分別沖洗3遍。
[0011](5)貯存:待清洗液抽空，制備好的封閉膠用PBS懸起，約10mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0012]伏馬毒素抗體膠和HRP抗體膠的制備
[0013](1)溶脹:準(zhǔn)確稱取0.50g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，攪拌溶脹lOmin (溶脹后膠的終體積約為1.8mL)。
[0014](2)淋洗:將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到在具砂板層析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶聯(lián)緩沖液沖洗柱子，調(diào)節(jié)柱子pH至中性，將淋洗液全部淋完。
[0015](3)偶聯(lián)抗體:取1.50mg/mL抗體，用lmL的偶聯(lián)緩沖液稀釋，然后加入到在具砂板層析柱中，密封柱子，室溫下震蕩反應(yīng)2h。
[0016](4)封閉:加入10mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗柱子，然后加入10mL的封閉液，再次密封柱子，室溫震湯反應(yīng)2h。
[0017](5)清洗:首先加入10mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗一次，然后用10mL的醋酸鈉緩沖溶液和10mL的偶聯(lián)緩沖液分別沖洗3遍；
[0018](6)貯存:待清洗液抽空，制備好的抗體膠用PBS懸起，約5mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0019]HRP抗體膠由HRP多克隆抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)后制得，用于免疫親和凝膠檢測柱的對(duì)照層。HRP抗體膠的制備步驟同抗體膠制備過程。
[0020]將所述封閉膠和抗體膠(HRP抗體膠)按一定比例混合制備凝膠檢測柱的質(zhì)控層和檢測層，即:
[0021](1)質(zhì)控層是由HRP抗體膠與封閉膠以一定比例混合好后，取150 μ L混合膠加入到lmL的SPE塑料柱中，用注射器活塞將PBS壓出；
[0022](2)檢測層是由優(yōu)化好的抗體膠與封閉膠以一定的比例混合好后，取150 μ L加入其中，用注射器活塞將PBS壓出；
[0023]進(jìn)一步的，所述質(zhì)控層和檢測層，制備檢測柱，即:
[0024](1)檢測柱由下到上，分別是對(duì)照層和檢測層，對(duì)照層和檢測層之間隔開一個(gè)3mm的空氣層，可以防止加入底物顯色后試劑和顏色從對(duì)照層迀移到檢測層中。
[0025](2)首先將聚乙烯墊片加入lmL的塑料柱中，然后加入對(duì)照層混合膠，加入第二層聚乙烯墊片，在對(duì)照層上方約3mm處加入第三層聚乙烯墊片，然后加入其檢測層的混合膠，最后在頂部加入第四層墊片。
[0026]本發(fā)明創(chuàng)造所述的免疫檢測柱相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)勢:
[0027](1)本發(fā)明提供的伏馬毒素免疫親和凝膠檢測柱，可專一識(shí)別伏馬毒素，具有非常尚的選擇性。
[0028](2)本發(fā)明伏馬毒素免疫親和凝膠檢測柱是一種可視化的定性半定量檢測產(chǎn)品。對(duì)目標(biāo)待測物的檢測，檢測柱會(huì)以檢測層顏色的有無給出檢測結(jié)果，即以是/否的可視定性信號(hào)給予應(yīng)答，操作方便，結(jié)果判斷簡單。
[0029](3)本發(fā)明制得的伏馬毒素免疫親和凝膠檢測柱既可以使之與凈化柱串聯(lián)，消除樣品基質(zhì)影響；又可容納較大體積的清洗緩沖液和樣品溶液，提高了方法靈敏度。檢測產(chǎn)品前處理方法簡便，快速，穩(wěn)定性好，所用試劑均無毒、無污染，具有很好的易用性和準(zhǔn)確性，滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。
【附圖說明】
[0030]構(gòu)成本發(fā)明創(chuàng)造的一部分的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的進(jìn)一步理解，本發(fā)明創(chuàng)造的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明創(chuàng)造，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0031]圖1為本發(fā)明創(chuàng)造實(shí)施例所述的凝膠檢測柱的組裝示意圖；
[0032]1-注射器，2-轉(zhuǎn)接頭，3-進(jìn)樣口，4-聚乙烯墊片，5-檢測層，6-空氣層，7-質(zhì)控層，8-出口。
[0033]圖2為本發(fā)明創(chuàng)造實(shí)施例所述的伏馬毒素凝膠檢測柱檢測限的判定:伏馬毒素濃度從左到右分別為:0 μ g/L, 20.0 μ g/L, 30.0 μ g/L, and 40.0 μ g/L ；
[0034]圖3本發(fā)明創(chuàng)造實(shí)施例所述的伏馬毒素凝膠檢測柱特異性的判定(與其它真菌毒素的交叉反應(yīng)結(jié)果)，從左至右依次為:(a) FBI濃度為40 μ g/L ； (b)FB2濃度為100 μ g/L ；(c) OTA 濃度為 1000 μ g/L ； (d) ZEN 濃度為 1000 μ g/L
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明創(chuàng)造。
[0037]實(shí)施例1
[0038]1、伏馬毒素抗血清的純化
[0039]采用Protein A — Sepharose 4B作親合層析介質(zhì)純化伏馬毒素抗血清，可一次性獲得接近純度較高的特異性抗體。具體操作步驟為(1)平衡:用平衡緩沖液(0.2mol/L的磷酸緩沖液)沖洗管路，平衡柱子，至基線平穩(wěn)。(2)上樣:用平衡緩沖液將伏馬毒素特異性抗血清等體積稀釋后上柱。(3)洗雜:用平衡緩沖液洗雜至雜蛋白的紫外吸收峰出現(xiàn)后繼續(xù)沖洗至基線平穩(wěn)。(4)洗脫收集:用0.lmol/L pH 2.7的甘氨酸緩沖液洗脫特異性IgG抗體。當(dāng)紫外吸收曲線呈上升趨勢，收集特異性抗體。并迅速用Tris-HCl中和抗體至中性。(5)封柱:抗體收集完成后迅速用醋酸緩沖液酸化純化柱后，用平衡緩沖液中和純化柱，最后用20%乙醇飽和封柱。將純化收集的抗體，用pH7.4的磷酸緩沖液4°C透析三天后取出，測定抗體蛋白濃度，添加0.1% (w/v)的疊氮鈉