一種抗生素檢測(cè)試紙條及其制備方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及β -內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)抗生素檢測(cè)試紙條及其制備方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛在養(yǎng)殖過(guò)程中易患疾病，由于抗生素藥效好、價(jià)格低廉，奶農(nóng)在奶?；疾r(shí)大量使用，尤其是內(nèi)酰胺類(lèi)，四環(huán)素類(lèi)和黃胺類(lèi)抗生素被大量使用，導(dǎo)致原料乳中抗生素殘留現(xiàn)象普遍，長(zhǎng)期攝入含抗生素的食品，可造成藥物積累，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，就會(huì)對(duì)人體的健康帶來(lái)一系列負(fù)面影響，如產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性等。更為重要的是，抗生素被過(guò)量食入健康人腸道，會(huì)破壞健康人的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力的降低，從而危害消費(fèi)者的身體健康。歐盟、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家都制定了牛奶、肌肉和腎臟等動(dòng)物源性食品中該類(lèi)藥物的最高殘留限量(MRL)，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)文件公告對(duì)其MRL也做了嚴(yán)格規(guī)定，該類(lèi)藥物在牛奶中的MRL為4?100 μ g/L,在肌肉、肝臟和腎臟中的MRL為50?1000 μ g/kg。但極少量的產(chǎn)品能夠達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]目前，常用的檢測(cè)方法中微生物受阻檢測(cè)方法成本價(jià)低，但是靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)、耐藥菌的存在容易導(dǎo)致誤檢；儀器檢測(cè)方法精確度高，但其存在檢測(cè)成本高，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員的要求較高，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，目前常用的免疫學(xué)分析法前處理過(guò)程較為復(fù)雜，不能實(shí)現(xiàn)樣品的大規(guī)模檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的β -內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)抗生素檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的缺陷，提供一種靈敏度高，方便快捷的內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)抗生素檢測(cè)試紙條及其制備方法、應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種抗生素檢測(cè)試紙條，包括底板，所述底板上依次粘貼有樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊，所述反應(yīng)膜上設(shè)有包被有內(nèi)酰胺抗原的檢測(cè)線(xiàn)Β、包被有四環(huán)素抗原的檢測(cè)線(xiàn)Τ、包被有磺胺類(lèi)抗原的檢測(cè)線(xiàn)S和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線(xiàn)C，所述結(jié)合墊上包被有β -內(nèi)酰胺特異性抗體-膠體金標(biāo)記物、磺胺類(lèi)特異性抗體-膠體金標(biāo)記物和四環(huán)素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0006]進(jìn)一步地，所述反應(yīng)膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有檢測(cè)線(xiàn)S、檢測(cè)線(xiàn)Τ、檢測(cè)線(xiàn)Β和質(zhì)控線(xiàn)C。
[0007]進(jìn)一步地，所述底板為PVC底板。
[0008]進(jìn)一步地，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0009]進(jìn)一步地，所述β -內(nèi)酰胺抗原、四環(huán)素抗原和磺胺類(lèi)抗原分別為β -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素-載體蛋白、四環(huán)素類(lèi)抗生素-載體蛋白和磺胺類(lèi)抗原抗生素-載體蛋白。
[0010]進(jìn)一步地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白的一種。[0011 ] 改進(jìn)地，所述樣品墊上還設(shè)有MAX標(biāo)記線(xiàn)。
[0012]更進(jìn)一步地，所述樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次搭接粘貼到所述底板上。
[0013]—種制備試紙條的方法，包括以下步驟:
[0014]1)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；
[0015]2)制備含有β -內(nèi)酰胺特異性抗體-膠體金標(biāo)記物、四環(huán)素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物和磺胺類(lèi)特異性抗體-膠體金標(biāo)記物這3種膠體金標(biāo)抗體的混合物；
[0016]3)結(jié)合墊的包被:將步驟2)制備的3種膠體金標(biāo)抗體混合物包被到所述結(jié)合墊上，包被后干燥；
[0017]4)反應(yīng)膜的包被:將羊抗鼠IgG、β -內(nèi)酰胺抗原，四環(huán)素抗原和磺胺類(lèi)抗原包被到反應(yīng)膜上，分別制得質(zhì)控線(xiàn)C、檢測(cè)線(xiàn)Β、檢測(cè)線(xiàn)Τ和檢測(cè)線(xiàn)S，包被后干燥；
[0018]5)試紙條的組裝:在所述底板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊。
[0019]抗生素檢測(cè)試紙條在牛奶抗生素檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的一種抗生素檢測(cè)試紙條，在反應(yīng)膜上設(shè)有包被有β -內(nèi)酰胺抗原的檢測(cè)線(xiàn)Β、包被有四環(huán)素抗原的檢測(cè)線(xiàn)Τ、包被有磺胺類(lèi)抗原的檢測(cè)線(xiàn)S和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線(xiàn)C，以及在結(jié)合墊上包被有β -內(nèi)酰胺特異性抗體-膠體金標(biāo)記物、磺胺類(lèi)特異性抗體-膠體金標(biāo)記物和四環(huán)素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的能夠?qū)崿F(xiàn)一次對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素和磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)，由于在結(jié)合墊上直接包被這3類(lèi)抗生素的特異性抗體-膠體金標(biāo)記物，所述不需要另外設(shè)包被有膠體金標(biāo)抗體提的微管，直接將待測(cè)樣品滴加或?qū)⒃嚰垪l插入到樣品中進(jìn)行檢測(cè)即可。
[0021]本發(fā)明的試紙條具有以下有益效果:本發(fā)明的試紙條檢測(cè)快速，僅需要5-10min ;攜帶方便；靈敏度高；操作簡(jiǎn)便，不需要對(duì)樣品進(jìn)行處理，也不需要單獨(dú)準(zhǔn)備特異性抗體-膠體金標(biāo)記物，直接將樣品滴加或?qū)⒃嚰垪l插入樣品即可一次對(duì)3類(lèi)抗生素進(jìn)行檢測(cè)；便于儲(chǔ)存、保質(zhì)期長(zhǎng)；可工業(yè)化生產(chǎn)；生產(chǎn)成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0022]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0023]圖1為本發(fā)明的抗生素檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]圖2為抗生素檢測(cè)試紙條的結(jié)果判斷示意圖。
[0025]圖中，1-底板；2_樣品墊；3_結(jié)合墊；4_反應(yīng)膜；5_吸水墊。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例，僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0027]實(shí)施例1:試紙條的制備
[0028]1.1膠體金顆粒的制備
[0029]取0.01 % HAuC14水溶液100mL置于燒杯內(nèi)；加入2mLl %檸檬酸三鈉水溶液，用恒溫電磁攪拌器加熱煮沸15min左右，直至溶液呈紅色；室溫冷卻后加入0.5mL 0.2mol/LK2C(V混勻。此法制備的膠體金顆粒直徑為15nm，且大小均一。將制備好的膠體金顆粒置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0030]1.2特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0031]取30mL膠體金溶液加于50mL離心管中，用0.1M 1(20)3或0.1M HC1調(diào)節(jié)pH至
7.0-7.5，用鋁箔紙包住離心管，輕輕振蕩；邊振蕩邊逐滴加入lmL含lOOugP -內(nèi)酰胺特異性抗體溶液，繼續(xù)振蕩20min ;邊振蕩邊逐滴加入lmL含lOOug四環(huán)素特異性抗體溶液，繼續(xù)振蕩20min ;邊振蕩邊逐滴加入lmL含100ug磺胺類(lèi)特異性抗體，繼續(xù)振蕩20min ;逐滴加入2mL 1% BSA溶液以飽和游離的膠體金，然后于4°C，lOOOOrpm,離心45min。離心后取出離心管，輕輕將上清液吸掉一部分后，用移液槍將管底沉淀的混合有3種膠體金標(biāo)抗體的混合物吸至2mL的離心管中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032]其中，β -內(nèi)酰胺特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的β -內(nèi)酰胺特異性抗體是用β-內(nèi)酰胺抗原作為免疫原制備獲得，β -內(nèi)酰胺特異性抗體可為β-內(nèi)酰胺單克隆抗體或β -內(nèi)酰胺多克隆抗體；磺胺類(lèi)特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的磺胺類(lèi)特異性抗體是用磺胺類(lèi)抗原作為免疫原制備獲得，磺胺類(lèi)特異性抗體可為磺胺類(lèi)單克隆抗體或磺胺類(lèi)多克隆抗體；四環(huán)素特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的四環(huán)素特異性抗體是用四環(huán)素抗原作為免疫原制備獲得，四環(huán)素特異性抗體可為四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素類(lèi)多克隆抗體；其中，
內(nèi)酰胺抗原，四環(huán)素抗原和磺胺類(lèi)抗原分別為內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素-載體蛋白、四環(huán)素類(lèi)抗生素-載體蛋白和磺胺類(lèi)抗生素-載體蛋白的偶聯(lián)物，載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白。其中，單克隆抗體的使用進(jìn)一步增加了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0033]1.3結(jié)合墊的包被
[0034]將1.2制備的3種膠體金標(biāo)抗體的混合物用抗體稀釋液(20mM PB，200mM NaCl，1% BSA,0.1% Triton X-100，2%蔗糖，0.01 % Proclin 300)進(jìn)行 5 倍稀釋后均勻噴涂在結(jié)合墊3上，37°C真空干燥，即得包被有膠體金標(biāo)抗體的結(jié)合墊3。
1.4反應(yīng)膜的包被
[0035]采用金標(biāo)噴涂?jī)x在反應(yīng)膜4上分別平行噴涂羊抗鼠IgG、β -內(nèi)酰胺抗原，四環(huán)素抗原和磺胺類(lèi)抗原，分別制得羊抗鼠IgG質(zhì)控線(xiàn)C、β -內(nèi)酰胺抗原檢測(cè)線(xiàn)Β、四環(huán)素抗原檢測(cè)線(xiàn)Τ和磺胺類(lèi)抗原檢測(cè)線(xiàn)S，噴涂后37°C真空干燥后備用，反應(yīng)膜4上從樣品墊2到吸水墊5方向依次包被有檢測(cè)線(xiàn)S、檢測(cè)線(xiàn)T、檢測(cè)線(xiàn)B和質(zhì)控線(xiàn)C。β -內(nèi)酰胺抗原，四環(huán)素抗原和磺胺類(lèi)抗原分別為內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素-載體蛋白、四環(huán)素類(lèi)抗生素-載體蛋白和磺胺類(lèi)抗生素-載體蛋白的偶聯(lián)物，其中載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白。該反應(yīng)膜4可以為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜。
1.5試紙條的組裝
[0036]先將反應(yīng)膜4粘貼到底板1上，該底板1為PVC底板，再將膠體金結(jié)合墊3和樣品墊2逐一粘貼在底板1上，稍為用力壓住反應(yīng)膜4，然后把吸水墊5粘好，其中樣品墊2、結(jié)合墊3、反應(yīng)膜4和吸水墊5為依次搭接粘貼到底板1上，樣品墊2上還可貼有MAX標(biāo)記線(xiàn)，將組裝好的試紙條用專(zhuān)用切條機(jī)切割成3.5mm寬的試紙條，最后將試紙條與干燥劑裝入專(zhuān)用的塑料小桶，8條試紙每桶，密封包裝。在2?8°C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月，同時(shí)也可在室溫下保存。