一種含迷迭香酸的凝血酶時間測定試劑的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?015104204159的分案申請，申請日為2015-07-16,申請名稱 為"一種凝血試劑用抗氧化劑"。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及一種含迷迭香酸的凝血酶時間測定試劑。
【背景技術】
[0003] 凝血測試屬于血栓性疾病檢查，其中，凝血酶時間（TT)為凝血功能檢查的一個重 要指標，用于檢查血漿纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白能力。
[0004] 凝血酶時間測定試劑的核心組份為凝血酶。凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶， 具有與胰凝乳蛋白酶相似的序列與結構，含A、B兩條多肽鏈，由一個鏈間二硫鍵相連。B鏈 為功能鏈，具有典型的絲氨酸蛋白水解酶折疊結構，含有1個位于兩個β折疊桶之間的活 性中心，2個外結合位點（ExositeI、ExositeII)。凝血酶功能團和三維結構，會因為物 理和化學條件的變化而遭受破壞。
[0005] 凝血酶時間檢驗是在手動、半自動或全自動凝血儀上進行的，它將診斷試劑與待 測血漿混合，以測定凝血時間。目前，凝血酶時間診斷試劑以干粉制劑為主，因為冷凍干燥 是保護凝血酶蛋白活性的一種有效方法。一般情況下，干粉試劑需要添加定量的復溶液或 去離子水使其復溶，恢復到凍干前的溶液狀態(tài)，但是，復溶過程耗時，同時，凝血酶的濃度與 凍干前會有差異，如果操作不當，會引起凝血酶變性，導致凝血酶濃度值降低，凝血時間延 長。
[0006] 與干粉狀凝血試劑相比，液態(tài)凝血酶試劑可克服復溶過程或凍干過程帶來的缺 陷，為用戶帶來使用的便捷，同時也提高了檢測結果的準確性和精確性，但是，液體試劑也 給研發(fā)者帶來了諸多挑戰(zhàn)性問題。凝血酶屬于生物大分子，它的活性依賴于其自身的精細 空間結構的維系。在液態(tài)狀態(tài)下，蛋白質或酶的結構比較脆弱，酸、堿、溫度、離子強度以及 其它某些化合物（包括重價金屬離子）的少量存在，都會引起這種空間結構的改變，局部結 構的微小變化也會引起蛋白質或酶活性的喪失。凝血酶的變性或活性的降低，部分是由外 界因素引起的，但在一定條件下，蛋白質或酶也會自分解，導致整體活性下降。因此，需要盡 量消除可能促使蛋白質或酶發(fā)生自分解的條件。
[0007] 氧化是導致凝血酶失活或活性降低的重要原因之一，即某些特定的氨基酸殘基發(fā) 生反應，導致凝血酶功能與結構上變化，對氧化物的親和力增強，易于聚合、交聯而導致其 功能失活。
[0008] 蛋白質類組織中的反應性氧系包括羥基自由基，一般蛋白質和脂質的氧化都是由 自由基鏈式反應引起，涉及去氫、電子傳遞、加成、斷裂和重排、二聚、歧化和取代，與脂肪氧 化一樣，同樣包括起始、傳遞與終止三個階段。因此，合適的抗氧化劑的加入，可保持液態(tài)凝 血酶試劑的穩(wěn)定性。
[0009] 在制備含抗氧化劑的凝血試劑方面，專利EP942284A2、US5506146、US5314695和 US8729022B2,提出加入氨基酸（主要是甘氨酸）作為抗氧化劑。
[0010] 根據查詢的文獻資料，凝血試劑中添加的抗氧化劑大概包括3類，一是氨基酸及 其衍生物，以甘氨酸為主要表現形式；二是酸性己糖衍生物，包括抗壞血酸；三是包括丁基 羥基茴香醚和丁基羥基甲苯在內的其它抗氧化劑。
[0011] 在液態(tài)凝血酶時間測定試劑中，根據國內外研究文獻檢索，大多采用多醇或多糖 類或鹽酸鹽作為凝血酶的穩(wěn)定劑，同時添加疊氮酸鈉作為抗菌劑或穩(wěn)定劑，這些穩(wěn)定劑的 選擇，基本上遵循了干粉凝血試劑的生產思路，在穩(wěn)定液態(tài)凝血試劑方面，效果并不盡如 意。如前所述，多醇或多糖類物質，能夠提升凝血酶的穩(wěn)定性，但這類物質的過量加入，會增 加混合液的粘度，從而降低采用光學法測定的凝血酶時間測定試劑的準確度，而過量氯酸 鹽的加入，會提高溶液相的離子強度。疊氮酸鈉具有較好的抗菌性能，但是它的毒性較大。
[0012] 在實驗研究的基礎上，本發(fā)明人發(fā)現，在優(yōu)化傳統穩(wěn)定劑的基礎上，添加迷迭香 酸，并合理控制它的加入濃度，會很好地提升液態(tài)環(huán)境中凝血酶的穩(wěn)定性。它的加入，會蟄 合溶液相中不利于凝血酶穩(wěn)定的金屬離子，從而降低了二價金屬離子對凝血酶氧化反應的 催化作用；同時，也會與過氧自由基發(fā)生反應，終止蛋白質過氧化鏈反應，從而進一步提升 了試劑的穩(wěn)定性能。
[0013] 在上述研究的基礎上，本發(fā)明基于抗氧化性的差異和濃度對產物的影響，提出以 含有鄰苯二酚結構和相對較小分子量的酚酸作為液態(tài)凝血酶試劑的抗氧化劑。更特別的， 選擇迷迭香酸作為不同凝血試劑的抗氧化劑，以提升不同凝血試劑的抗氧化性能。

【發(fā)明內容】

[0014] 本發(fā)明的目的，是在常規(guī)凝血試劑的基礎上，提出一種高效、無毒的抗氧化劑，它 可以防止凝血試劑中蛋白質的氧化，消除一般抗氧化劑抗氧化性能不足的問題，為凝血試 劑（TT)帶來更好的抗氧化性。
[0015] 本發(fā)明提出的迷迭香酸屬于酚類的一類，按WBSSH的分類，大多數酚類都具有不 同程度的抗氧化性，但并不是所有的酚類都可以用于凝血試劑的抗氧化劑。有研究發(fā)現，蛋 白質可以與酚類相互作用，導致蛋白質沉淀[1] [2]，另一方面，Asano等[3] [4]認為，含有 脯氨酸殘基的蛋白質在與酚類類化合物絡合時容易產生沉淀，因為脯氨酸殘基或其它疏水 性氨基酸含量高的蛋白質對酚類的親和力比較強。因此，并不是所有的酚類都可以用于凝 血試劑，尤其是TT測定試劑的抗氧化劑。
[0016] TT測定試劑的主要組成為凝血酶。為了驗證酚類對凝血酶活性的影響，本發(fā) 明將一定濃度的凝血酶與不同類型的酚類混合，采用發(fā)光基物濃度的變化，確定不同類 型的酚類對凝血酶活性的影響。具體地，用Sonder等人[5]提出的方法，測定發(fā)光基物 D-Phe-Pip-Arg-pNA的水解程度，以確定人凝血酶的活性，S卩用96孔酶標儀測定415nm處的 吸光度值，每孔中加入發(fā)光基物，同時加入與酚類預培養(yǎng)后的人凝血酶。確定各吸光曲線中 最大反應值，并根據曲線估算IC50值，即凝血酶酰胺分解活性抑制50%時對應的酚類的濃 度。
[0017]結果表明，在選擇的酚類中，不同的酚類對凝血酶的活性影響不同，添加表兒茶酸 和兒茶酸時，導致人凝血酶活性減少50%時對應的添加濃度較高，介于130-150mM之間；添 加單寧酸時，即使較低的濃度（1. 42mM)，也將使人凝血酶的濃度減少50%。丹酚酸或迷迭 香酸對凝血酶活性的影響，受加入濃度的影響，當加入濃度介于0. 01-2mM時，基本不影響 凝血酶的活性，同時提升試劑穩(wěn)定效果。同時，黃酮類酚類對人凝血酶具有最大的抑制效 果，這與Jedinak[6]和Mozzicafreddo[7]等人的研究結果是吻合的。這一結論，也可以根 據Liu[8]、Li[9]和Shi[10]等人從分子對接方面的研究結果得到驗證，他們的研究表明， 在黃酮結構的B環(huán)中，-OH基越多，對凝血酶的抑制就越大；黃酮結構的B環(huán)與C環(huán)，會分別 與凝血酶結構中的S1鏈袋和S2鏈袋反應，A環(huán)會部分地與凝血酶S3鏈袋反應，而B環(huán)中 的3' -羥基與4' -羥基官能團，以及C環(huán)上的其它3' -羥基團，都會抑制凝血酶的活性。
[0018] 本發(fā)明在上述實驗的基礎上，進一步說明，雖然酚類都具有不同程度的抗氧化性， 但并非所有的酚類都可以用于凝血試劑的抗氧化劑或穩(wěn)定劑。
[0019] 在實驗研究的基礎上，從抗氧化性相對強弱出發(fā)，提出以迷迭香酸作為凝血試劑 的抗氧化劑。
[0020] 本發(fā)明的凝血試劑用抗氧化劑，為酚酸，具體為迷迭香酸。
[0021] 本發(fā)明所述的迷迭香酸，含有鄰苯二酚結構，鄰苯二酚結構具有如下的優(yōu)勢：
[0022] 1)鄰苯二酚結構具有很強的金屬離子蟄合能力，從而降低了二價金屬離子對氧化 反應的催化作用，特別地，在制備凝血試劑的過程中，所用原料中的少量重金屬離子，會破 壞組織因子或凝血酶的穩(wěn)定。因此，它起到Η)ΤΑ鈉鹽或鉀鹽及部分氨基酸對金屬離子的螯 合作用。
[0023] 2)鄰苯二酚結構能夠與過氧自由基發(fā)生反應，從而終止蛋白質氧化或脂質過氧化 鏈反應，這一點對含有凝血酶的凝血酶時間測定試劑更為重要。
[0024] 另一方面，當酚酸的分子量較大時，會含有較多的酚羥基，這樣可以增加酚酸與蛋 白質之間的反應機率，易于形成酚酸（或酚類）_蛋白質的交聯網狀結構，導致蛋白質不穩(wěn) 定。因此，本發(fā)明在選擇酚酸類時，盡量選擇分子量較小的含有鄰苯二酚結構的酚酸類。同 時，結合實驗研究，優(yōu)選迷迭香酸。
[0025] 本發(fā)明優(yōu)選的迷迭香酸，分子式為C1SH160S，分子量為360。作為天然抗氧化劑，迷 迭香酸具有極強的清除自由基的活性，其抗氧化性強于咖啡酸、綠原酸、葉酸等。西北輕工 業(yè)學食品工程系進行的評價試驗證明，迷迭香酸抗氧化劑具有比丁基羥基甲苯更強的抗氧 化作用[11]。根據鄒坤[12]等人的研究，迷迭香酸抗氧化作用機理包括直接與活潑自由基 反應，即阻斷自由基鏈的傳鏈過程，從而阻斷自由基鏈式反應；與誘導氧化的過渡金屬離子 (包括二價鐵離子）絡合，達到抗氧化效果。
[0026] 在本發(fā)明中，所述迷迭香酸在TT測定試劑中的濃度為0.01_2mM。
[0027] 本發(fā)明的目的，是提供一種采用迷迭香酸作為抗氧化劑的TT凝血試劑，由含有 25U/ml人凝血酶、2 %牛血清白蛋白、1. 5mM迷迭香酸、0. 05 %的疊氮酸鈉、3. 5 %蛋氨酸、 1. 5%PEG、3%甘露醇、2. 5%麥芽糖和10mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液組成，其中的百分比 均為質量體積比，pH為7. 4。
[0028] 上述含迷迭香酸的凝血酶時間測定試劑的制備方法，步驟如下：配制Tris濃 度50mM、pH7. 4的緩沖液，向該緩沖液中，加入終濃度分別為2%的BSA、1. 5mM迷迭香酸、 0. 05 %的疊氮酸鈉、3. 5 %的蛋氨酸、1. 5 %的PEG、3 %的甘露醇、2. 5 %的麥芽糖、10mM的氯 化鈣，其中除氯化鈣外，其余均為質量體積分數；將上述混合液用0. 22微米濾膜過濾，在濾 液中加入人凝血酶凍干制劑，使終濾液中人凝血酶的濃度為25U/ml，得到TT測定試劑。
[0029]本發(fā)明所述迷迭香酸，可以配合其它抗氧化劑共同使用，以進一步提升凝血試劑 的抗氧化能力，改善凝血試劑的穩(wěn)定性能。所述的其它抗氧化劑包括酸類抗氧化劑如抗壞 血酸，氨基酸類抗氧化劑如甘氨酸、蛋氨酸，這類添加劑的加入量，可按一般凝血試劑中的 加入量添加。
[0030] 由于酚類能夠抑制包括絲氨酸蛋白酶在內的許多酶的活性[13]，且酚類和蛋白質 能相互作用導致蛋白質沉淀，因此，目前少有將酚類物質用作凝血試劑穩(wěn)定劑的報道。而本 發(fā)明發(fā)現，在凝血試劑中加入一種或多種酚類，可顯著提升混合液的穩(wěn)定性。本發(fā)明通過抗 自由基活性分析，確定了適合的酚類類型為迷迭香酸；同時，對酚類和凝血酶之間的反應作 了分析，并在此基礎上，提出了制備凝血酶時間試劑中迷迭香酸的加入的濃度值。本發(fā)明 通過對酚類種類及濃度