用于檢測dna雜交的可重復使用的長周期微光纖光柵的制作方法
【專利說明】用于檢測DNA雜交的可重復使用的長周期微光纖光柵
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求美國臨時專利申請序列號61/997，620的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時專利申請在2014年6月6日提交并且它的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及一種對用于檢測脫氧核糖核酸雜交、具有提高的靈敏度的無標記、可重復使用的長周期微光纖光柵生物傳感裝置、其制造方法以及其用途。
【背景技術(shù)】
[0004]生物傳感器具有廣泛的應(yīng)用，包括用于醫(yī)療診斷的生物標志物檢測、以及食品和水中的病原體和毒素檢測。一般生物傳感器使用熒光免疫測定來檢測分析物，然而，這種方法的缺點在于需要對抗原或靶DNA進行熒光標記。這需要額外的試劑并且可能干擾正常的生物過程。此外，這種方法成本高、復雜、并且不可能實時檢測。
[0005]為了克服這些缺點，已經(jīng)應(yīng)用了許多方法來研發(fā)無標記的檢測生物傳感器。具體來說，得到很多關(guān)注的是光纖生物傳感器，其中源于光纖的裝置使用光場來測量生物物質(zhì)，如細胞、蛋白質(zhì)以及DNA。不同于它們對應(yīng)的一般生物傳感器，光纖生物傳感器利用無標記的檢測。由于它們的效率、電勢靈敏度、檢測速度以及小體積、對分析物的可變的和多重的檢測，光纖生物傳感器正越來越多地被應(yīng)用于工業(yè)過程和環(huán)境監(jiān)測、食品加工以及臨床應(yīng)用中。
[0006]許多光纖生物傳感器是基于表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象。然而，在SPR生物傳感器的情況下，生物傳感器的SPR特性取決于金屬、它的厚度以及生物分子。因此，需要仔細地設(shè)計并且制造SPR生物傳感器，這會造成成本升高。為了克服這些缺點，已經(jīng)設(shè)計出基于光纖光柵的生物傳感器。特別地，設(shè)計出具有在共振波長下協(xié)助模式耦合的長周期光柵(LPG)的折射率的生物傳感器，所述折射率對光纖外部介質(zhì)的變化敏感。用于生物傳感的LPG傳感器的優(yōu)勢包括制造簡單以及容易通過簡單地調(diào)節(jié)光柵周期將共振波長很好地調(diào)節(jié)到光源的光譜內(nèi)。其以實現(xiàn)檢測生物分子(如DNA)的高靈敏度的可調(diào)諧性也使得LPG傳感器成為靈敏的DNA生物傳感器的理想候選者。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在本發(fā)明中，提供了一種基于長周期微光纖光柵(LPMFG)的靈敏的DNA生物傳感器，所述長周期微光纖光柵被寫到包層蝕刻的或錐形的光纖上。LPMFG的包層被顯著減少以增強纖芯基模與外部介質(zhì)之間的相互作用以實現(xiàn)更高的靈敏度。本發(fā)明的生物傳感器使用了 LPMFG的耦合模式特性的構(gòu)思來確定病毒DNA是否附著到生物傳感器的表面。LPMFG從纖芯模到包層模來耦合光的能力允許在光柵表面光學檢測折射率的變化，從而提供監(jiān)測生物分子相互作用的光學檢測方法。LPMFG病毒傳感器通過靶病毒ssDNA與固定探針ssDNA之間的雜交的生物分子相互作用來導致光柵表面上折射率的變化而起作用。
[0008]根據(jù)上述背景，本發(fā)明的目的在于提供一種微光纖中的無標記、可重復使用的長周期光柵裝置及其制造方法，所述長周期光柵裝置具有提高的靈敏度，用于檢測和感測脫氧核糖核酸雜交。該制造微光纖中的無標記、可重復使用的長周期光柵裝置的方法包括使用耦合器制造臺(可商購獲得的或任何常規(guī)的制造臺)使單模光纖成為錐形，用氫焰軟化并且使平移臺對稱地移動分開;使所述微光纖的兩個單模光纖尾纖與發(fā)光二極管(LED)和光譜分析儀連接;使用聚焦脈沖式C02激光，以小的縱向拉伸應(yīng)變在微光纖上進行掃描來沿著縮徑的光纖(RDF)周期性地產(chǎn)生微錐形；以及重復掃描程序N次以制造具有N-1個周期的長周期光柵。
[0009]在一個實施方案中，由所述方法制造的長周期光纖光柵具有約45μπι的直徑、約385μπι的柵距、約20個周期以及當被浸泡在具有約1.33的折射率的液體中時約1544.5nm的陷波。
[0010]在另一個實施方案中，用于檢測脫氧核糖核酸雜交的提高的靈敏度是約0.055(每單位摩爾濃度的波長偏移)。
[0011]在又另一個實施方案中，所述脫氧核糖核酸是病毒脫氧核糖核酸。
[0012]在又另一個實施方案中，微光纖具有數(shù)百納米至數(shù)微米的直徑以及長于30mm的有效束腰長度。
[0013]在又另一個實施方案中，所述聚焦⑶2激光包含以下參數(shù):脈沖寬度:2.0ys，重復率:10kHz，以及平均功率:約0.02W。
[0014]在另一個實施方案中，將掃描程序重復5至26次;所述掃描程序在以下參數(shù)下進行:掃描長度:5至10mm;掃描速度:3mm/s;和/或拉速:0.17mm/s。
[0015]在其它實施方案中，所述長周期光纖光柵具有5至24個周期。
[0016]在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種使用本發(fā)明的可重復使用的長周期微光纖光柵裝置對脫氧核糖核酸雜交進行無標記檢測以及使所述裝置再生的方法。所述方法包括提供對于與一種或多種靶DNA雜交具有特異性的脫氧核糖核酸探針;將所述脫氧核糖核酸探針固定在所述裝置的光柵表面上以形成活性光柵表面;將所述靶DNA的脫氧核糖核酸樣品遞送到所述裝置的所述活性光柵表面；以超高的靈敏度檢測所述光柵表面處的折射率的變化;以及使所述裝置的所述活性光柵表面再生。
[0017]在一個實施方案中，所述脫氧核糖核酸包含病毒脫氧核糖核酸。
[0018]在另一個實施方案中，重復使用所述可重復使用的長周期微光纖光柵，包括在雜交之后使用分別包含0.5%SDS溶液(pH 1.9)、10mM NaOH溶液、以及10mM HC1溶液的混合物使與探針DNA雜交的靶DNA的DNA雙鏈體斷裂，以再生所述活性光柵表面。
[0019]在又另一個實施方案中，所述活性傳感器表面在重復所述再生之后保持10次連續(xù)測定而沒有任何顯著的性能損失。
[0020]在又另一個實施方案中，所述顯著的性能損失低于10%的降低。
[0021]在又另一個實施方案中，將特異性脫氧核糖核酸探針固定在所述光柵表面上進一步包括將傳感器表面用3-氨基丙基-三乙氧基甲硅烷(APTS)硅烷化，將所述裝置浸入到辛二亞氨酸二甲酯(DMS)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中以形成交聯(lián)劑，以通過使所述活性光柵表面與含有所述特異性DNA探針的ssDNA的PBS—起孵育來固定所述探針的ssDNA。
【附圖說明】
[0022]圖1顯示可商購的耦合器制造臺。
[0023]圖2顯示用于制造微光纖中的LPG的C02激光系統(tǒng)的示意圖。
[0024]圖3顯示在微光纖中制造以形成本發(fā)明的LPMFG的LPG:(a)顯示沿著光纖的周期性的微錐形的顯微鏡圖像；(b)顯示具有在6.3μπι直徑的微光纖上制成的兩個微錐形的細節(jié)的顯微鏡圖像；以及(c)顯示具有在6.3μπι直徑的微光纖上制成的兩個微錐形的細節(jié)的SEM圖像。
[0025]圖4顯示具有45μπι直徑的錐形光纖。
[0026]圖5顯示直徑為45μπι的長周期光柵的光譜。發(fā)現(xiàn)折射率靈敏度為922nm/RIU。
[0027]圖6A顯示LPG DNA傳感器在H5禽流感DNA探針與ΙμΜ Η5禽流感DNA靶標雜交的情況下的波長偏移。靈敏度:3.60 X 10~-3(nm/M)。
[0028]圖6B顯示LPG DNA傳感器在H5禽流感DNA探針與0.5nM H5禽流感DNA靶標雜交的情況下的波長偏移。靈敏度:4.00(nm/M)。
[0029]圖7A顯示LPG DNA傳感器在H7禽流感DNA探針與ΙμΜ Η7禽流感DNA靶標雜交的情況下的波長偏移。靈敏度:3.70 X 10~-3(nm/M)。
[0030]圖7B顯示LPG DNA傳感器在H7禽流感DNA探針與0.5nM H7禽流感DNA靶標雜交的情況下的波長偏移。靈敏度:4.40(nm/M)。
[0031]圖8顯示兩條完全互補的ssDNA(探針ssDNA和靶病毒ssDNA)的DNA雜交的示意圖。
[0032]圖9顯示基于DNA雜交的LPMFG病毒傳感器的原理。
[0033]圖10A顯示LPG DNA傳感器在H5禽流感DNA探針與0.5nM H5禽流