在激光掃描共聚焦顯微鏡上的單重態(tài)氧顯微成像方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在激光掃描共聚焦顯微鏡上的單重態(tài)氧顯微成像方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單重態(tài)氧是處于第一電子激發(fā)態(tài)的氧氣，其光譜學(xué)符號(hào)為Oja1 Λ g)。眾所周知，氧氣廣泛存在于我們周圍的環(huán)境(大氣、土壤和水體等)和生物體內(nèi)，對(duì)環(huán)境和生物體有著至關(guān)重要的作用。作為氧氣的第一電子激發(fā)態(tài)，單重態(tài)氧很容易在環(huán)境和生物體內(nèi)產(chǎn)生，從而也會(huì)對(duì)環(huán)境和生物體產(chǎn)生深刻的影響。
[0003]目前，最為普遍的單重態(tài)氧檢測(cè)方法是紅外輻射法，該方法通過(guò)檢測(cè)單重態(tài)氧躍遷到基態(tài)02(Χ3Σε_(tái))發(fā)出的1240nm— 1340nm范圍的紅外發(fā)光來(lái)獲得單重態(tài)氧的信息。相比于普通熒光，單重態(tài)氧的紅外發(fā)光強(qiáng)度極其微弱。單重態(tài)氧的自發(fā)輻射壽命長(zhǎng)達(dá)65分鐘，而普通熒光的自發(fā)輻射壽命為幾個(gè)納秒，在發(fā)光分子數(shù)量同樣多的情況下，單重態(tài)氧的紅外發(fā)光強(qiáng)度僅為普通熒光強(qiáng)度的約10 12倍。因此，紅外輻射法在對(duì)微尺寸樣品，如細(xì)胞中的單重態(tài)氧檢測(cè)時(shí)遇到了極大的困難，不僅是因?yàn)閱沃貞B(tài)氧的紅外發(fā)光信號(hào)隨樣品尺寸的縮小而迅速降低，更因?yàn)樗枰陲@微鏡平臺(tái)下進(jìn)行，這樣才能夠獲得微尺寸樣品中的單重態(tài)氧的準(zhǔn)確發(fā)光位置和在該位置上的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光壽命等信息。
[0004]目前，在顯微鏡系統(tǒng)上對(duì)微尺寸樣品和細(xì)胞中的單重態(tài)氧檢測(cè)已有報(bào)導(dǎo)。十幾年前，Peter R.0gilby等人就在一臺(tái)普通熒光顯微鏡上實(shí)現(xiàn)了多聚物和細(xì)胞的單重態(tài)氧發(fā)光強(qiáng)度成像(Accounts Of Chemical Research, 37:894-901，2004)。相比于普通突光顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是更高的分辨率、可對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，不但可以獲得每一點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度，配以時(shí)間相關(guān)記錄裝置還可以測(cè)出每一點(diǎn)的發(fā)光壽命，從而得到單重態(tài)氧在樣品中的動(dòng)力學(xué)信息。但至今為止在激光掃描共聚焦顯微鏡上的單重態(tài)氧成像還未能實(shí)現(xiàn)，原因很可能是激光掃描共聚焦顯微鏡中的掃描頭所導(dǎo)致，掃描頭中的復(fù)雜光學(xué)元件會(huì)大幅度衰減本來(lái)就非常微弱的單重態(tài)氧紅外發(fā)光，使之無(wú)法被掃描頭后的光信號(hào)檢測(cè)器所探測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供在激光掃描共聚焦顯微鏡上實(shí)現(xiàn)單重態(tài)氧顯微成像的方法。采用該方法，可在激光掃描共聚焦顯微鏡上獲得單重態(tài)氧的發(fā)光強(qiáng)度成像和發(fā)光壽命成像，進(jìn)而更方便于研究單重態(tài)氧與環(huán)境和生物體的相互作用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]激光掃描共聚焦顯微鏡物鏡的兩端，一端為面向檢測(cè)樣品的樣品端，另一端為激光入口端，于物鏡激光入口端的前方放置一塊二向分色鏡，該二向分色鏡能夠?qū)⒔?jīng)物鏡收集后所形成的單重態(tài)氧紅外發(fā)光光束與樣品的其它波段發(fā)光光束分成兩束光，單重態(tài)氧紅外發(fā)光光束不經(jīng)過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡的掃描頭而到達(dá)激光掃描共聚焦顯微鏡的其中一個(gè)光探測(cè)器，轉(zhuǎn)化成電信號(hào)被信號(hào)記錄裝置記錄下來(lái)而獲得樣品的發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光壽命的顯微成像；
[0008]所述單重態(tài)氧是指處于第一電子激發(fā)態(tài)的氧氣分子02 (a1 Δ g)；
[0009]所述單重態(tài)氧紅外發(fā)光是指單重態(tài)氧躍遷到基態(tài)02(Χ3Σβ_)時(shí)發(fā)出的波長(zhǎng)范圍為1240nm — 1340nm的紅外光。
[0010]為更好地收集單重態(tài)氧紅外發(fā)光，同時(shí)兼顧更好地收集其它波段發(fā)光，二向分色鏡應(yīng)設(shè)置于激光入口端正前方，與物鏡的焦平面的夾角在30° — 60°之間，以45°為佳。
[0011]二向分色鏡的特點(diǎn)是對(duì)某波段光高透過(guò)而對(duì)另一波段光高反射，吸收則很小而基本上可忽略。通常的二向分色鏡是對(duì)短波長(zhǎng)光有利于透過(guò)而對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)光有利于反射。為有效地將單重態(tài)氧紅外發(fā)光與樣品的其它波段發(fā)光分離，要求二向分色鏡在1240nm —1340nm波段的反射率在45 % — 99.99 %，相應(yīng)的透過(guò)率則在0.01 % — 55 %。二向分色鏡的入射角度以45°為佳。
[0012]為便于置入顯微鏡中，二向分色鏡為方形或圓形，其邊長(zhǎng)或直徑應(yīng)限定在5_ —75mm之間，厚度在0.5mm 一 3mm之間。
[0013]實(shí)現(xiàn)單重態(tài)氧顯微成像的先決條件是樣品中存在單重態(tài)氧。在【背景技術(shù)】部分已提到，氧氣廣泛存在于我們周圍的環(huán)境和生物體內(nèi)，因此，在通常的環(huán)境下制備出來(lái)的樣品或多或少都會(huì)含有氧氣。在有些場(chǎng)合，樣品還需要在更高氧氣含量甚至純氧氣氛圍下制備來(lái)提高樣品中的氧氣含量。在單重態(tài)氧顯微成像中，單重態(tài)氧是由樣品本身所含的氧氣在紫外可見光光照以后經(jīng)由光敏化過(guò)程產(chǎn)生的，事先需要往樣品中加入單重態(tài)氧光敏劑，單重態(tài)氧光敏劑在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.0lppm以上，或者如果樣品本身就是單重態(tài)氧光敏劑，則質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，單重態(tài)氧光敏劑具體為CM、C7。、苯、葉啉中的一種或兩種以上。
[0014]單重態(tài)氧的光敏化產(chǎn)生過(guò)程是這樣的:紫外可見光照射光敏劑，處于自旋單重態(tài)的基態(tài)光敏劑分子吸收光子能量后變成自旋單重態(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子，由于具有共軛環(huán)結(jié)構(gòu)，自旋單重態(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子很容易通過(guò)系間穿越過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)樽孕貞B(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子，自旋三重態(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子最后把能量傳遞給氧氣產(chǎn)生單重態(tài)氧?？梢钥闯?，單重態(tài)氧光敏劑對(duì)于單重態(tài)氧的產(chǎn)生是必不可少的，僅光照氧氣本身并不會(huì)產(chǎn)生單重態(tài)氧，只有在單重態(tài)氧光敏劑存在的情況下，光照氧氣才能產(chǎn)生單重態(tài)氧。
[0015]單重態(tài)氧光敏劑的結(jié)構(gòu)特征是具有共軛環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣，自旋單重態(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子才能夠很容易地通過(guò)系間穿越過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)樽孕貞B(tài)的激發(fā)態(tài)光敏劑分子。因此，所述的單重態(tài)氧光敏劑就是指在紫外可見光照射下能將氧氣轉(zhuǎn)變?yōu)閱沃貞B(tài)氧的具有共軛環(huán)結(jié)構(gòu)的單質(zhì)或有機(jī)物。由于單重態(tài)氧光敏劑的光吸收波段通常是300nm — 780nm的紫外可見區(qū)，為有效產(chǎn)生單重態(tài)氧，激光掃描共聚焦顯微鏡的激發(fā)激光是300nm — 780nm波段的紫外可見激光。為進(jìn)行發(fā)光壽命測(cè)量，還要求激光掃描共聚焦顯微鏡所用的激光器是脈沖重復(fù)頻率為1kHz - 100MHz、脈沖寬度為10ps — 10ns的脈沖激光器。
[0016]需要指出的是，取決于不同的環(huán)境，單重態(tài)氧紅外發(fā)光的中心波長(zhǎng)和范圍均有所不同。在氣相中，單重態(tài)氧紅外發(fā)光是一個(gè)中心波長(zhǎng)為1268nm、范圍在1245nm — 1295nm的發(fā)光。但在液相和固相的樣品環(huán)境中，單重態(tài)氧紅外發(fā)光的中心波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生紅移，發(fā)光的波長(zhǎng)范圍也有所擴(kuò)大。但無(wú)論如何，單重態(tài)氧紅外發(fā)光均來(lái)自于^(a1 Λg — X3Sg_)自發(fā)輻射躍遷。
[0017]激光掃描共聚焦顯微鏡所用的光探測(cè)器是光電管、光電倍增管、光電二極管中的一種或二種以上，但為探測(cè)出極微弱的單重態(tài)氧紅外發(fā)光，其中的光探測(cè)器D1是紅外光電倍增管。
[0018]本發(fā)明的基本思路是:激光掃描共聚焦顯微鏡的掃描頭極大地衰減了單重態(tài)氧紅外發(fā)光，通過(guò)在物鏡激光入口端那一側(cè)加入二向分色鏡，樣品返回的單重態(tài)氧紅外發(fā)光可不經(jīng)過(guò)掃描頭就被直接送給激光掃描共聚焦顯微鏡的其中一個(gè)光探測(cè)器D1，極大降低了單重態(tài)氧紅外發(fā)光的衰減，從而可被顯微鏡的光探測(cè)器所檢測(cè)。這樣一來(lái)，由于單重態(tài)氧紅外發(fā)光不經(jīng)過(guò)掃描頭，成像的分辨率自然就直接取決于物鏡樣品端那一側(cè)焦點(diǎn)的激光光斑大小，雖然降低了成像分辨率，但卻實(shí)現(xiàn)了單重態(tài)氧顯微成像；即通過(guò)犧牲成像分辨率來(lái)?yè)Q取單重態(tài)氧顯微成像的實(shí)現(xiàn)。
[0019]有益技術(shù)效果
[0020]采用該方法，可在激光掃描共聚焦顯微鏡上獲得單重態(tài)氧的發(fā)光強(qiáng)度成像和發(fā)光壽命成像，進(jìn)而更方便于研究單重態(tài)氧與環(huán)境和生物體的相互作用。
【附圖說(shuō)明】
[0021]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0022]圖1單重態(tài)氧顯微成像裝置示意圖；其中，
[0023]1-倒置顯微鏡(la-樣品，lb-載物臺(tái)，lc-物鏡)、2_掃描頭(2a_鏡筒透鏡，2b_掃描透鏡，2c_掃描振鏡)、3_皮秒脈沖激光器、4-光探測(cè)器(Dl、D2、D3)、5_信號(hào)記錄裝置(時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)卡)、6_裝有掃描控制卡和成像軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)^a-計(jì)算機(jī)和軟件，6b-掃描控制卡)、7_ 二向分色鏡、8-拍攝單重態(tài)氧發(fā)光光譜時(shí)紅外CCD光譜儀的安放位置、9-紅外(XD光譜儀、10-透鏡；
[0024]圖2單重態(tài)氧紅外發(fā)光光譜；
[0025]圖3單重態(tài)氧紅外發(fā)光的衰減曲線；
[0026]圖4單重態(tài)氧和光敏劑C6。粉末的發(fā)光壽命成像和發(fā)光強(qiáng)度成像，其中，
[0027]A是單重態(tài)氧紅外發(fā)光強(qiáng)度成像；
[0028]B是C6。粉末的熒光強(qiáng)度成像；
[0029]C是單重態(tài)氧紅外發(fā)光壽命成像；
[0030]D是C6。粉末的熒光壽命成像；
[0031]E是單重態(tài)氧紅外發(fā)光壽命分布圖，壽命集中分布在3 — 4ms ;
[0032]F是C6。粉末的熒光壽命分布圖，壽命集中分布在300 - 400ps。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1
[0034]單