促黃體生成素lh定量測定試劑盒及其制備方法與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械生物類免疫體外診斷領域，主要涉及一種基于磁微粒分離化 學發(fā)光法定量檢測血液中促黃體生成素LH的試劑盒及其制備方法，W及應用該試劑盒定 量檢測血液中促黃體生成素LH的方法。
【背景技術】
[0002] 促黃體生成素（Luteinizing化rmone，LH)是由腦垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一 種糖蛋白激素，受下丘腦促性腺釋放激素控制，是垂體分泌的促性腺激素之一，主要作用是 促進排卵和黃體生成，W促進黃體分泌雌激素巧2)和孕激素（P)。LH分子量約為28. 5kDa， 像其它糖蛋白如FSH、T甜和HCG-樣，也是由α和目亞基組成的。送類激素的α亞基的 結構是很相似的，因此，送些激素的生物學和免疫學特性的區(qū)別取決于其獨特的目亞基。 正常人血清LH基礎值為5~10IU/L。
[0003] 促黃體生成素LH對于男性和女性的性腺功能各方面的調節(jié)具有重要的作用。在 女性體內，LH調節(jié)月經(jīng)周期，促使卵泡生長與成熟，合成雌激素和孕麗，促使排卵及黃體形 成。在男性體內，LH調節(jié)睪丸激素的產(chǎn)生。此外，LH對于下丘腦垂體有一定影響。因此， LH的測定對于男性和女性不育的判斷、月經(jīng)失調的研究、更年期的指示、絕經(jīng)期的征兆W及 垂體失調、染色體失常和其他卵巢或睪丸相關疾病的診斷提供有用的信息。
[0004] 在國內，促黃體生成素LH檢測臨床上主要依靠國外進口試劑和免疫組化試劑應 用為主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經(jīng)濟負擔，不利于在基層普及。具 有自主知識產(chǎn)權的國產(chǎn)促黃體生成素LH免疫化學發(fā)光檢測試劑盒目前還較少，也僅停留 在96孔微孔板式技術水平上。該技術靈敏度較低、線性窄、特異性較差，也不利于高通量的 全自動檢測。
[0005] 因此，有待開發(fā)對促黃體生成素LH檢測靈敏度高與可靠性并能降低檢測成本的 檢測技術。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種新的可定量檢測促黃體生 成素LH的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下的技術方案：
[0008] -方面，本發(fā)明提供了一種促黃體生成素LH定量測定試劑盒，該試劑盒包括校準 品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物。
[0009] 其中：
[0010] -、促黃體生成素LH校準品、促黃體生成素LH質控品的配制方法如下：
[0011] 用標準品緩沖液溶解促黃體生成素LH，配置促黃體生成素LH校準品、促黃體生成 素LH校準品，其中，所述校準品緩沖液是通過在1L健康男性血清中加入0.Olg~0. 05g的 四環(huán)素和0.Ig~0. 5g硫酸新霉素，溶解后經(jīng)過0. 22μm濾膜處理制備；
[0012] 二、抗試劑的制備方法如下：
[001引（1)、抗試劑緩沖液的制備：
[0014] Tris;12. 12mg~60. 57mg，四環(huán)素；0.Olg~0. 05g，綿羊血清；Ig~5g，新生牛血 清3g~lOg，馬血清Ig~5g加入1L純化水中，充分攬拌至完全溶解；
[0015] (2)、異硫氯酸英光素與促黃體生成素LH的偶聯(lián)，獲得異硫氯酸英光素標記的促 黃體生成素LH包被抗體：
[0016] 首先用抗試劑緩沖液將異硫氯酸英光素配制成濃度為1. 0~5.Omg/血的異硫氯 酸英光素溶液，使用分光光度計在495皿處讀取吸光值，來調整濃度，然后按照促黃體生成 素LH抗體與異硫氯酸英光素的質量之比為1:1. 3,將二者同時轉移到蹤色玻璃瓶中，室溫 下攬拌1~2小時，充分反應后使用抑=8~9的碳酸氨鹽緩沖液進行平衡，然后凝膠層 析分離純化得到的異硫氯酸英光素標記的促黃體生成素LH包被抗體；紫外監(jiān)測，記錄儀記 錄純化圖譜，同時注意確認含有連接物的試管，注意、避光防護。
[0017] (3)、堿性磯酸酶與促黃體生成素LH抗體的偶聯(lián)，獲得堿性磯酸酶標記的促黃體 生成素LH標記抗體：
[0018] 首先用抗試劑緩沖液將堿性磯酸酶配制成濃度為1. 0~5.Omg/mL的堿性磯酸酶 溶液，可W根據(jù)分光光度計在280皿處讀取吸光值，將堿性磯酸酶的吸光值應該在一定的 范圍內。然后按照堿性磯酸酶與促黃體生成素LH的摩爾比為1:2~1:10的量將二者轉移 至蹤色瓶中，室溫下攬拌4~5小時，充分反應后使用抑=8~9的碳酸氨鹽緩沖液平衡， 然后使用凝膠層析分離純化得到的堿性磯酸酶標記的促黃體生成素LH標記抗體；注意含 有連接物的試管的避光防護。
[001引 （4)、將步驟似中獲得的異硫氯酸英光素標記的促黃體生成素LH包被抗體和和 步驟（3)中獲得的堿性磯酸酶標記的促黃體生成素LH標記抗體，加入含有表面活性劑的 化is鹽緩沖液充，分攬拌后獲得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween20、化itonX-100、 化onidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0. 01%~0. 5%。
[0020] H、磁微粒試劑的制備：
[0021] 將抗異硫氯酸英光素抗體與駿基磁珠偶聯(lián)制得磁微粒試劑。
[0022] (1)、取一定體積的充分混勻后的駿基磁珠濃縮液至反應瓶中，將該反應瓶在磁場 放置15min，待駿基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應瓶中加入2~5倍于反應瓶中駿基磁 珠體積的磁微粒緩沖液，混勻20-30min。再將反應瓶置于磁場中15min后吸去上清。重復 清洗駿基磁珠3遍。最后將駿基磁珠溶液定容到10-50mg/mU混勻；所述磁微粒緩沖液的 配置方法是；Tris;12. 12mg，氯化鋼5. 82mg，甲基纖維離50g，加入1L純化水中，充分攬拌 至完全溶解；
[0023](2)、連接反應；按照駿基磁珠與抗異硫氯酸英光素抗體質量比為100:1的比例， 在駿基磁珠中加入抗異硫氯酸英光素抗體，2~8°C內保持混勻狀態(tài)反應18小時；
[0024](3)、反應瓶在在磁場放置15min，待駿基磁珠沉降后用磯酸緩沖液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒試劑。
[00巧]四、發(fā)光底物的制備
[0026] 將ALI^溶解于發(fā)光底物緩沖液中制備發(fā)光底物。
[0027] 用4~10倍于ALI^體積的發(fā)光底物緩沖液充分溶解ALPS,所述發(fā)光底物緩沖液 的配置方法是；Tris12. 12g~121. 14g，氯化鋼5.82g，光澤精0.03g，加入1L純化水中，充 分攬拌至完全溶解，用鹽酸調節(jié)緩沖液的抑至9. 5。
[0028] 進一步的，本發(fā)明的促黃體生成素LH定量測定試劑盒，該試劑盒還包括清洗液。 該清洗液主要用于在檢測過程中清洗與磁微粒試劑反應后的樣品，清洗液的具體組分可W 參照所屬領域的常規(guī)操作進行。通常是磯酸二氨鋼、氯化納、Tween20和ProcLin300的混 合溶液，在試劑盒制品中可W濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當稀釋后使用。優(yōu)選的清洗 液的配置方法是；Tris12. 12g，氯化鋼5. 82g，Tween-2050血，曲拉通-100, 50血，加入1L純 化水中，充分攬拌至完全溶解。
[0029] 另一方面，本發(fā)明提供了送種促黃體生成素LH定量測定試劑盒的制備方法，包括 W下步驟。
[0030] 分別配制促黃體生成素LH校準品、促黃體生成素LH質控品、抗試劑、磁微粒試劑、 發(fā)光底物；將促黃體生成素LH校準品、促黃體生成素LH質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發(fā)光 底物獨立地置于包裝容器內，得到促黃體生成素LH的定量測定試劑盒。
[0031] 本試劑盒的異硫氯酸英光素標記的促黃體生成素LH包被抗體為能與人體內促黃 體生成素LH抗原特異結合的單克隆抗體，所述堿性磯酸酶標記的促黃體生成素LH標記抗 體為能與促黃體生成素LH抗原特異結合的單克隆抗體。包被抗體和標記抗體除能與促黃 體生成素LH抗原特異性結合外，配對使用時可與抗原形成"H明治"夾必結構。
[0032] 再一方面，本發(fā)明提供了利用送種促黃體生成素LH定量測定試劑盒檢測促黃體 生成素LH的方法，該方法包括步驟：
[0033] (1)取Η支試管分別加30μL促黃體生成素LH的校準品、30μL促黃體生成素LH 的質控品、30μL待測樣本；
[0034] 似每一試管中加入60μL抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37 °C下水浴15分鐘；
[0035] (3)每一試管中加入30μL磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s， 置37 °C下水浴5分鐘；
[0036] (4)將Η支試管在磁分離器上沉淀2分鐘，緩慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清 液，把倒轉的試管連同磁分離器一起放在濾紙上，用力拍擊磁分離器底部W除去粘在管壁 上的所有液滴；
[0037] (5)每支試管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混 勻后緩慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同磁分離器一起放在濾紙 上，用力拍擊分離器底部W除去粘在