豬圓環(huán)病毒2型競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒，特別設(shè)及一種豬圓環(huán)病毒2型競(jìng)爭(zhēng)化ISA抗體檢測(cè)試劑 盒，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬 成員，是迄今為止動(dòng)物病毒中最小的病毒之一，直徑為17nm，二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜。病毒基 因組由單股閉合環(huán)狀DNA組成，含有1766~1769核骨酸（OlveraA，CorteyM，Segal自S J.Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:Phylogenyand clonality[J].Virology，2007,357(2):175~185;加angL.P.'LuY.H.'WeiY.W.'et al.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformational neutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMC Microbiol. 2011a，11:188. )dPCV2基因組主要包含2個(gè)大的開放閱讀框架(ORFl和0RF2) (CheungAΚ.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2.Virology, 2003,305:168-180. )d0RF1編碼復(fù)制酶相關(guān)蛋白，參與病毒的復(fù)制，0RF2編碼Cap蛋白，是病 毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是該病毒診斷方法研制的理想靴抗原化iuC， IharaT，NunoyaT，etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMed Sci. ,2004,66(3) :237~242.)。雖然PCV2只有一個(gè)血清型，然而卻分為多種基因型，包括 PCV2a、PCV化、PCV2C和PCV2d等。這些基因型的差異使其Cap蛋白抗原性存在差異dPCV2多抗 不能識(shí)別這些差異，只有單抗可W區(qū)分（SahaD.，HuangL.P.，BussalleuE.，et al.Antigenicsubtypingandepitopes'competitionanalysisofporcine circovirustype2usingmonoclonalantibodies.Vet.Microbiol.2012，157:13-22; HuangL.P.，LuY.H.，WeiY.W.，etal.Identificationofonecriticalaminoacid thatdeterminesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidprotein ofporcinecircovirustype2.BMCMicrobiol.2011a,11:188.)〇
[0003] PCV2是引起臨床上發(fā)生PMWS疾病的主要病原體，但其致病機(jī)制尚未完全闡明。 Meerts等（PeterMeerts，GeraldMisinzo，DavidLefebvre，JensNielsen，Anette Botnet；CharlotteSKristensen,HansJNauwynek.Correlationbetweenthe presenceofneutralizingantibodiesagainstporcinecircovirus2(PCV2)and protectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddiseased].BMCVetRes2006,2:6-16.)研究表明，豬體內(nèi)缺乏PCV2中和抗 體與病毒復(fù)制能力增強(qiáng)有關(guān)，因體內(nèi)中和抗體效價(jià)較化，不能夠完全中和體內(nèi)病毒增殖，最 終發(fā)展成為臨床raws疾病。為了進(jìn)一步證實(shí)這種觀點(diǎn)，F(xiàn)ort等(FortM，01veraA，Sibila Μ,SegalesJ，MateuE:Detectionofneutralizingantibodiesinpostweaning multisystemicwastingsyndrome(PMWS)-affectedandnon-PMWS-affectedpigs[J] .VetMicrobiol2007，125 : 244-255.)進(jìn)行了系統(tǒng)試驗(yàn)，應(yīng)用血清中和試驗(yàn)、IPMA和定量PCR檢測(cè)PMWS豬、沒(méi)有PMWS表現(xiàn)而PCV2陽(yáng)性豬W及PCV2陰性豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中和抗體與血清 中病毒載量呈負(fù)相關(guān)，中和抗體增長(zhǎng)的同時(shí)病毒數(shù)量明顯下降;PMWS豬血清中和抗體水平 明顯低于沒(méi)有PMWS表現(xiàn)而PCV2陽(yáng)性豬。可見(jiàn)中和抗體在清除血液循環(huán)中PCV2和疾病康復(fù)過(guò) 程中發(fā)揮重要作用。因此，體液免疫在PCV2相關(guān)疾病方面可能占有重要地位。
[0004] 用于PCV2血清抗體檢測(cè)的方法主要IIF、IPMA、間接化ISA、阻斷化ISA、競(jìng)爭(zhēng)化ISA 和免疫膠體金技術(shù)等，其中WIIF和IPMA最為經(jīng)典和常用，盡管運(yùn)兩種方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)， 但是在結(jié)果判定方面存在一定的主觀性，難于實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)需要使其推廣受到 限制?；谥亟M蛋白建立的間接化ISA具有較好的特異性，但其敏感性低于IPMA(張朝霞， 長(zhǎng)明，危艷武，等，豬圓環(huán)病毒2型化ISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 報(bào)，2008,30(7): 548-551;張志慧，危艷武，吳洪麗，等，豬圓環(huán)病毒2型幾種化ISA抗體檢測(cè) 試劑盒的比較與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014,36(2) :129-133),上述幾種方法檢測(cè)結(jié) 果不能直接反應(yīng)PCV2中和抗體。本發(fā)明利用PCV2中和性單抗建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA法可W直接 檢測(cè)血清中和抗體，具備規(guī)?；可a(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)要求，特異性強(qiáng)，敏感 性與IPM相當(dāng)，為該病毒疫苗免疫及臨床發(fā)病動(dòng)物血清抗體的檢測(cè)提供了一種有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型競(jìng)爭(zhēng)化ISA抗體檢測(cè)試劑盒，該 試劑盒操作簡(jiǎn)便，特異性好，敏感性高，為PCV2流行病學(xué)調(diào)查及血清抗體檢測(cè)提供了 一種有 效技術(shù)手段；
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種使用W上所述的試劑盒在制備檢測(cè)豬血清豬 圓環(huán)病毒2型抗體試劑中的應(yīng)用；
[0007] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的在于提供用于建立W上所述試劑盒的單克隆抗體及分泌該 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明W純化的PCV2作為免疫原，分別對(duì)6周齡雌性BALB/c鼠進(jìn)行3次免疫。首免， 每只鼠注射腹腔50yg(0.5ml)的純化病毒；間隔3周進(jìn)行二免，免疫原、劑量和方法同上;再 間隔2周相同方法加強(qiáng)免疫。
[0010] 按常規(guī)方法無(wú)菌采取免疫鼠脾細(xì)胞，用PEG1450進(jìn)行融合。采用IPMA方法篩選抗 PCV2單抗，具體操作方法參照文獻(xiàn)巧IJ長(zhǎng)明，張超范，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型免疫過(guò)氧化 物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007,29(8):621 ~6 2 4 .)，雜交瘤上清液作為一抗，ΗRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG巧+L)作為檢測(cè)二抗，經(jīng)檢測(cè)，將 IPMA檢測(cè)為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆， 克隆3次，將獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞及時(shí)凍存。
[0011] 經(jīng)IPMA檢測(cè)篩選，獲得1株分泌抗豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞 株，命名為PCV2-Cap-3A5,分類命名為分泌抗PCV2-Cap-3A5單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院中科院微生物研究所，其微生物保藏號(hào)為：CGMCCNO.10205，保藏時(shí)間為2014年12月22 曰。
[0012] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明利用得到的單克隆抗體建立了一種豬圓環(huán)病毒2型競(jìng)爭(zhēng)化ISA抗體檢測(cè)試 劑盒，其特征在于，包括采用間接的捕獲包被法包被豬圓環(huán)病毒2型抗原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記 的抗豬圓環(huán)病毒2型化P蛋白單克隆抗體。
[0014] 所述的單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞株命名為PCV2-Cap-3A5,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10205。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述采用間接的捕獲包被法包被抗原為先用豬圓環(huán)病毒2型 陽(yáng)性血清包被ELISA板W捕獲豬圓環(huán)病毒2型抗原;所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2/LG株培 養(yǎng)物，毒價(jià)為1Xl〇5TCI化o/ml;所述酶為辣根過(guò)氧化酶。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清的包被稀釋倍數(shù)為1:1000;所 述捕獲豬圓環(huán)病毒2型抗原的作用時(shí)間為化。
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、稀釋液、顯色液、洗 涂液和終止液。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為豬圓環(huán)病毒2型陰性血清;所述陽(yáng)性對(duì)照為 豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清;所述稀釋液為含有1%牛血清白蛋白的PBST緩沖液;所述顯色液 為ABTS工作液;所述洗涂液為PBST緩沖液;所述終止液為1 %的NaF溶液。
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