一種抗乙肝病毒HBx單克隆抗體及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種抗乙肝病毒皿X單克隆抗體、用 于制備該單克隆抗體的重組蛋白、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，W及該單克隆抗體 在用于檢測樣本中皿X的表達(dá)和用于制備檢測乙型病毒性肝炎、與乙肝相關(guān)肝癌樣本中皿X 檢測，W及病情預(yù)后評估的制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 統(tǒng)計資料表明，肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率接近60%，肝癌治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前影響 肝癌療效的重要因素（l.ShermanM.Recurrenceofhepatocellularcarcinoma.NEngl JMed2008;359:2045-2047.)。肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個十分復(fù)雜的問題，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)不 少的癌基因、生長因子和炎癥因子等與肝癌細(xì)胞侵襲性相關(guān)，多種細(xì)胞外基質(zhì)成分也有重 要作用（2.MannCD,NealCP，GarceaG，MansonMM,DennisonAR,BerryDP.Prognostic molecularmarkersinhepatocellularcarcinoma:asystematicreview.EurJ Cancer2007;43:979-992·)，且可能與原發(fā)瘤的基因特性有關(guān)（3.RoesslerS，JiaHL， BudhuA，F(xiàn)orguesM,YeQH,LeeJS，etal.Auniquemetastasisgenesignature enablespredictionoftumorrelapseinearly-stagehepatocellularcarcinoma patients.CancerRes2010:70:10202-10212.;4.YeQH，QinLX,ForguesM,HeP,Kim JW,PengAC，etal.PredictinghepatitisBvirus-positivemetastatic hepatocellularcarcinomasusinggeneexpressionprofilingandsupervised machinelearning.NatMed2003;9:416-423·)。我國屬于肝癌高流行區(qū)，全世界半數(shù)左右 的肝癌病人集中在我國，流行病學(xué)研究表明，乙肝病毒感染與我國肝癌發(fā)生密切相關(guān) (5.JemalA,BrayF,CenterMM,FerlayJ,WardE,FormanD.Globalcancer statistics.CACancerJClin2011;61:69-90·)。因此，研究乙型病毒性肝炎背景下肝癌 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制顯得尤為重要。文獻(xiàn)報導(dǎo)，乙肝病毒生活史與宿主細(xì)胞密不可分，乙肝病毒 需要依賴宿主細(xì)胞才能完成復(fù)制；乙肝病毒不但能夠整合到宿主細(xì)胞基因組，引起插入突 變;而且乙肝病毒表達(dá)的蛋白能夠與宿主細(xì)胞組成成分相互作用，從而干擾宿主細(xì)胞的正 常代謝和功能（6.FallotG，NeuveutC，BuendiaMA.DiverserolesofhepatitisB virusinlivercancer.CurrOpinVirol2012;2:467-473.)〇
[0003] 乙型肝炎病毒化BV)屬嗜肝DNA病毒科化epadnaviridae)，基因組長約3.化b，為部 分雙鏈環(huán)狀DNA。其基因組共有四個開放讀碼框，編碼W下一些蛋白：Core蛋白和pre-core 蛋白，Pol蛋白，X蛋白，[^及5蛋白化，M，S)(7.SeegerC,MasonWS.HepatitisBvirus biology.MicrobiolMolBiolRev2000;64:51-68.)。越來越多的研究表明，乙肝病毒X蛋 白化Bx)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HBx是一個僅有17kDa的可溶性蛋白，同時存在于細(xì)胞 核和胞質(zhì)。雖然冊X不能直接與DNA結(jié)合，但是冊X在宿主細(xì)胞中發(fā)揮的作用卻十分廣泛，參 與調(diào)控與細(xì)胞生存、稠亡相關(guān)的多種基因表達(dá)，比如c-jun，c-fos，ASC-2，c-Myc，pUuitary tumor-transforminggene1(PTTGl)等（8.TwuJS,LaiMY,ChenDS,民obinson WS.Activationofprotooncogenec-junbytheXproteinofhepatitisB virus.Virology1993;192:346-350.;9.KalraN,KumarV.TheXproteinofhepatitis BvirusbindstotheFboxproteinSkp2andinhibitstheubiquitinationand proteasomaldegradationofc-Myc.FEBSLett2006;580:431-436.;10.Molina-JimenezF，BenedictoI，MurataM，Martin-VilchezS，SekiT,AntonioPintor-ToroJ, etal.Expressionofpituitarytumor-transforminggene1(PTTGl)/securinin hepatitisBvirus(HBV)-associatedliverdiseases:evidenceforanHBVX protein-mediatedinhibitionofPTTGlubiquitinationand degradation.Hepatology2010;51:777-787.;ll.Kong町，ParkMJ,HongS,Yu町，Lee YC,ChoiYH，etal.HepatitisBvirusXproteinregulatestransactivation activityandproteinstabilityofthecancer-amplifiedtranscription coactivatorASC-2.Hepatology2003:38:1258-1266. )D冊X還能促進(jìn)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的 活性，比女日AP-1(12.TanakaY，KanaiF,IchimuraT，TateishiK，AsaokaY，GulengB，et al.ThehepatitisBvirusXproteinenhancesAP-1activationthrough interactionwithJabl.Oncogene2006;25:633-642.;13.KekuleAS,LauerU,WeissL, LuberB，HofschneiderPH.HepatitisBvirustransactivatorHBxusesatumour promotersignallingpathway.Nature1993；361:742-745.),NF-kB(14.ChirilloP, FalcoM，PuriPL,ArtiniM，BalsanoC，LevreroM，etal.HepatitisBviruspX activatesNF-kappaB-dependenttranscriptionthrougha民af-independent pathway.JVirol1996;70:641-646.)，androgenreceptor(AR)(15.ChiuCM,YehSH, ChenPJ，KuoTJ,ChangCJ，YangWJ，etal.HepatitisBvirusXproteinenhances 過打droge打receptor-respo打sivegeneexpressiondepe打di打go打過打droge打level.Proc NatlAcadSciUSA2007;104:2571-2578.)，C/EBP(16.ChoiBH'ParkGT'Rho HM.InteractionofhepatitisBviralXproteinandCCAAT/enhancer-binding protein過Iph過synergistic過lly過ctiv過testhehepatitisBvir過1enhancerII/ pregenomicpromoter.JBiolQiem1999;274:2858-2865·)。另一個重要的發(fā)現(xiàn)是，冊X能 夠影響線粒體的鉤離子釋放，該過程是冊V復(fù)制所需的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（17.BouchardMJ，Wang LH,Schneider民J.CalciumsignalingbyHBxproteininhepatitisBvirusDNA replication.Science2001:294:2376-2378·)，由于鉤離子是多種細(xì)胞中一種重要的信號 分子，所^冊^成為介導(dǎo)冊V與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵分子（IS.NassalM.Ca2+:化eclue tohepatitisBvirusXproteinfunction?Hepatology2002；36:755)0
[0004] 綜上，冊X是冊V病毒一