用于軟骨細胞應用的脂肪細胞的制作方法
【專利說明】用于軟骨細胞應用的脂肪細胞
[0001 ]本申請要求2013年6月19日提交的美國臨時專利申請系列號61/836,975的優(yōu)先權(quán)，所述文獻通過弓I用的方式完整并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明的領(lǐng)域至少包括藥學、外科學、解剖學、生物學、細胞生物學和/或分子生物學領(lǐng)域。在某些實施方案中，本發(fā)明的領(lǐng)域例如涉及用于治療與需要軟骨或軟骨細胞的身體部分或組織相關(guān)的醫(yī)學疾病的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0003]軟骨是位于哺乳動物中多個位置內(nèi)(至少包括骨間的關(guān)節(jié)、胸腔、耳、鼻、支氣管和椎間盤中)的撓性結(jié)締組織;它是比肌肉撓性更小的剛性物質(zhì)。軟骨按照比其他結(jié)締組織更慢的速率生長和修復，原因是軟骨不含血管;相反，軟骨細胞通過擴散得以補給，受到因壓縮關(guān)節(jié)軟骨或屈曲彈性軟骨所生成的抽吸作用輔助。另外，軟骨細胞固著在陷窩中并且不能移行至受損區(qū)域，從而軟骨損傷難以愈合。本發(fā)明至少為軟骨修復領(lǐng)域的需求提供解決方案。
[0004]發(fā)明概述
[0005]本發(fā)明涉及用于治療有需求的個體、包括治療需要修復軟骨的個體的系統(tǒng)、方法和組合物，所述治療例如包括修復彈性軟骨、透明軟骨或纖維軟骨。本發(fā)明涉及用于生物修復任何種類軟骨(例如包括椎間軟骨和關(guān)節(jié)軟骨)的方法和組合物。在具體方面，本發(fā)明涉及軟骨修復(如關(guān)節(jié)軟骨修復)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的實施方案包括在機械應力下生長、增殖和/或分化細胞成軟骨細胞樣細胞的方法，包括在體內(nèi)、離體或在體外實施該方法。
[0006]本發(fā)明涉及用于軟骨工程化以便為有需求的個體產(chǎn)生軟骨的方法和組合物。在具體實施方案中，本發(fā)明涉及治療軟骨缺陷的細胞和組織。本發(fā)明的一個示例性目的是提供修復和/或再生軟骨的方法。本發(fā)明的方法產(chǎn)生任何種類的軟骨，包括彈性軟骨、透明軟骨和/或纖維軟骨，其差異在其主要組分的相對量不同。
[0007]具體實施方案涉及與脂肪細胞在機械應變下分化成軟骨細胞樣細胞的用途相關(guān)的方法和組合物。在某些方面，本發(fā)明在體內(nèi)、離體或在體外例如從脂肪細胞產(chǎn)生天然組織。更具體地，但是非排他地，本發(fā)明涉及一種用于生長哺乳動物(如人類)脂肪細胞并使其分化成例如軟骨細胞樣細胞的方法。在某些實施方案中，細胞可以是自體的或同種異型的或其混合物。
[0008]在具體實施方案中，本發(fā)明利用某些細胞向軟骨細胞樣細胞的分化過程。在具體實施方案中，例如，脂肪細胞在特定條件下分化成軟骨細胞樣細胞。脂肪細胞分化成軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞可以按任何合適的方式進行，包括植入細胞后在體內(nèi)分化或植入之前在體外或離體分化。分化的細胞可以作為細胞或作為從細胞生成的組織生或其混合物遞送至個體。
[0009]在具體實施方案中，本發(fā)明提供一種用于體內(nèi)再生關(guān)節(jié)如椎間盤、肘、膝部、肩、髖、顳-下頌關(guān)節(jié)等的方法。在一些實施方案中，可以生成用于鼻或耳的軟骨組織。
[0010]在某些實施方案中，作為本發(fā)明應用重點的軟骨是椎間盤軟骨。在本發(fā)明的具體方面，本發(fā)明中所用的細胞經(jīng)歷椎間盤中存在的體內(nèi)機械應變和其他條件作用以便生軟骨性分化。
[0011 ]在本發(fā)明的一個目的中，提供一種用于修復變性椎間盤(例如恢復椎間盤解剖結(jié)構(gòu)和改善其履行職能)的方法。在本發(fā)明的具體方面，提供一種修復一個或多個受損椎間盤的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，存在一種修復個體的關(guān)節(jié)(如椎間盤)中受損軟骨的方法，所述方法包括遞送根據(jù)本發(fā)明的脂肪細胞至個體的相應關(guān)節(jié)(如椎間盤)。在本發(fā)明的具體實施方案中，在不摘出部分或全部變性椎間盤的情況下，將脂肪細胞(或在體外和/或離體分化成軟骨細胞樣細胞的脂肪細胞)遞送至椎間盤。在機械應力下，提供的細胞將獲得例如中央部分髓核細胞(nucleus ?611)和周邊纖維環(huán)細胞(&]111111118 cel I)的特征。
[0012]本發(fā)明的實施方案包括在椎間盤間隙中存在的機械應力或其他條件下生長、增殖和/或分化細胞成軟骨細胞樣細胞以產(chǎn)生離體軟骨的方法，所述離體軟骨隨后在體內(nèi)安置于個體內(nèi)。在本發(fā)明的具體方面，本發(fā)明中所用的細胞經(jīng)歷機械應變(mechanicalstrain)、低氧(例如，〈5%)或這二者以便生軟骨性分化。在一些實施方案中，存在一種將人脂肪細胞離體分化成軟骨細胞樣細胞的方法。
[0013]在本發(fā)明的某些方面，細胞分化成軟骨細胞細胞或軟骨細胞樣細胞，如其中軟骨細胞細胞或軟骨細胞樣細胞分泌選自聚集蛋白聚糖(aggrecan)、II型膠原蛋白、Sox_9蛋白、軟骨連接蛋白、基底膜蛋白聚糖及其組合的分子。在具體情況下，細胞從脂肪細胞分化而來，并且示例性脂肪細胞包括白色脂肪細胞或褐色脂肪細胞。
[0014]在具體實施方案中，體內(nèi)遞送細胞或源自其的組織至有需求的個體之前、期間或之后，向細胞提供生長因子，所述生長因子包括多種生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP_2)、BMP-4、BMP-6、BMP-7、軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)、轉(zhuǎn)化生長因子f3(TGF-f3)、胰島素生長因子I (IGF-1)、成纖維細胞生長因子(FGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、FGF-2、血小板衍生生長因子(PDGF)及其混合物;在可選實施方案中，體內(nèi)遞送細胞或源自其的組織至有需求的個體之前、期間或之后，這些生長因子或其他生長因子不提供給細胞。
[0015]在本發(fā)明的一些實施方案中，存在與遞送脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞至有需求的個體中體內(nèi)部位相關(guān)的方法和組合物。在具體實施方案中，該部位在體內(nèi)并需要軟骨細胞，包括需要軟骨。例如，需要軟骨細胞的部位包括關(guān)節(jié)，例如軟骨性關(guān)節(jié)(例如，椎骨)。在一些實施方案中，脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞從需要軟骨的個體獲得。在具體實施方案中，將脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞遞送到個體中的至少一個椎間盤。在一些情況下，獲得后，操作脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞，例如無論它們是否從有需求的個體獲得或無論它們是否從第三方或商業(yè)地獲得?？梢詫⒅炯毎?或再分化的脂肪細胞在培養(yǎng)物中擴充。在某些實施方案中，植入椎骨之前或期間或之后，不向脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞提供生長因子、基質(zhì)分子、機械應變或其組合。
[0016]在一些實施方案中，椎間盤中存在脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞及軟骨細胞。在一些實施方案中，體內(nèi)遞送的并非全部脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞將在椎間盤中分化成軟骨細胞，然而椎間盤中產(chǎn)生的組織則可用于改善椎間盤高度和生物力學功能。
[0017]在一些實施方案中，存在一種將人脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞在體內(nèi)分化成軟骨細胞樣細胞的方法，所述方法包括步驟:遞送脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞至個體的關(guān)節(jié)，其中在遞送之前，脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞不經(jīng)歷生長因子、基質(zhì)分子、機械應變或其組合作用;然而，在可選實施方案中，脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞經(jīng)歷生長因子、基質(zhì)分子、機械應變或其組合作用。在具體情況下，個體患有椎間盤疾病。在一些情況下，關(guān)節(jié)是椎間盤。
[0018]在一些實施方案中，椎間盤中一些未分化的脂肪細胞和分化的軟骨細胞樣細胞進一步限定為產(chǎn)生纖維性基質(zhì)分子、軟骨基質(zhì)分子或這兩者的細胞。在某些方面，軟骨細胞樣細胞進一步限定為產(chǎn)生基質(zhì)分子如膠原蛋白1、膠原蛋白I1、蛋白聚糖或其組合的細胞。在具體實施方案中，膠原蛋白包括I型和II型膠原蛋白。在一些情況下，蛋白聚糖之一是聚集蛋白聚糖。
[0019]在具體情況下，在椎間盤之間遞送脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞。在某些情況下，在內(nèi)層纖維環(huán)中髓核和裂隙之間或其內(nèi)部遞送脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞。
[0020]本發(fā)明方法的一些方面包括從個體或其他地方獲得脂肪細胞。獲得可以涵蓋從身體取出脂肪細胞或可以涵蓋恢復已經(jīng)獲得(如從第三方獲得，例如包括商業(yè)地獲得或從儲存獲得)的脂肪細胞。當脂肪細胞從身體取出時，它可以來自大腿、髖、臀部、腹、腰、上臂、背、膝內(nèi)、胸區(qū)、臉頰、頦部、頸、小腿和/或踝。
[0021]在某些方面，將脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞擴充，例如擴充至少I天。在一些情況下，將獲得的脂肪細胞傳代，例如不止一次。在具體方面，將脂肪細胞同時擴充并傳代。
[0022]在一些實施方案中，存在一種在個體的關(guān)節(jié)中產(chǎn)生軟骨組織(chondrocyticti ssue)的方法，所述方法包括步驟:遞送脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞至個體的關(guān)節(jié)，其中在遞送至關(guān)節(jié)之前或期間或之后，脂肪細胞和/或再分化的脂肪細胞尚未在體外暴露于生長因子、基質(zhì)分子、機械應變或其組合，不過在可選實施方案中，在遞送至關(guān)節(jié)之前或期間或之后，細胞在體外暴露于生長因子、基質(zhì)分子、機械應變或其組合。在具體實施方案中，軟骨組織包含具有特定生物化學標志物(例如I型和II型膠原蛋白和/或在軟骨和其他組織中存在的眾多蛋白聚糖)的細胞。
[0023]在本發(fā)明的某些實施方案中，在遞送至個體的關(guān)節(jié)之前和/或之后脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞的存在和/或脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞的死亡觸發(fā)來自一種或多種細胞的反應。在具體情況下，脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞的存在和/或脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞的死亡觸發(fā)來自關(guān)節(jié)中其他細胞的反應，并且其他細胞可以是任何種類，包括個體的內(nèi)源細胞，如軟骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、椎間盤干細胞等。在具體方面，內(nèi)源細胞反應包括刺激生長，例如隨著至少一些脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞在關(guān)節(jié)中死亡。因此，在具體實施方案中，脂肪細胞和/或再分化脂肪細胞的單純存在和/或當細胞死亡時胞內(nèi)因子釋放可以刺激來自椎間盤中現(xiàn)有細胞的細胞生長反應。在具