一種使用gc-ms法測(cè)定茶葉中生物堿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于茶葉的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種使用GC-MS法測(cè)定茶葉中生 物堿的方法，是涉及茶葉中煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的測(cè)定技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草生物堿是煙草極為重要的一類化學(xué)成分。煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿 是主要生物堿，通常稱除煙堿之外的其他生物堿為"次要生物堿"。煙草屬茄科煙屬，可分為 3個(gè)亞屬，即普通煙草、黃花煙草和碧冬煙草，共14組66種，在同一個(gè)種內(nèi)，煙草主要生物堿 含量相對(duì)穩(wěn)定，但不同種間生物堿含量差異極大。其中，50-60%的種以煙堿為主要生物堿， 煙堿占總生物堿比例在80%以上，包括有栽培利用價(jià)值的普通煙草和黃花煙草。30-40%的種 以降煙堿占優(yōu)勢(shì)，這些種具有煙堿轉(zhuǎn)甲基酶活性，煙堿在去甲基酶作用下大量轉(zhuǎn)化為降煙 堿，如在擬穗狀煙草中，其占總生物堿含量比高達(dá)92.7%。假木賊堿在5個(gè)種中為主要生物 堿，最高含量比可達(dá)86.7%(粉藍(lán)煙草），而新煙草堿通常在每個(gè)種中含量都不是絕對(duì)高，只 在少數(shù)種中含量相對(duì)較高。
[0003] 煙草中含有數(shù)十種次要生物堿，如降煙堿、新煙草堿、假木賊堿、麥斯明、可替寧、 2,3'_二啦啶、3,3'_二啦啶、二烯煙堿、N-甲基假木賊堿、二烯降煙堿等，其中降煙堿、新煙 草堿和假木賊堿的含量相對(duì)較高，研究也最多。次要生物堿在煙草中廣泛分布，但在其它植 物類含量甚少。僅有極少文獻(xiàn)報(bào)道一些其他茄科類植物中也可能含有次要生物堿，如白夜 丁香(Cestrum diurnum)不但含有煙堿，還含有降煙堿、可替寧和麥斯明，夜丁香(Cestrum nocturnum)含有煙堿和降煙堿，一些茄科澳洲毒茄屬植物也含有煙堿和降煙堿，其中有一 種灌木樹葉Duboisia hopwoodii，還被當(dāng)?shù)赝林用裼脕碇谱鹘罒?。但其他前科類植物?含有的次要生物堿種類與煙草有差異。茶葉作為人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｓ檬称?，?duì)于其中所 含生物堿的測(cè)定很有意義，但目前已公開的測(cè)定方法很少，曾有文獻(xiàn)報(bào)道茶葉中有煙堿的 檢出，但方法較為繁瑣。
[0004] 《YC/T 383-2010煙草及煙草制品煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測(cè) 定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》針對(duì)煙草產(chǎn)品開發(fā)了檢測(cè)方法，但是煙堿在煙草中的含量達(dá)到 3%的含量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于茶葉中的含量UOyg/kg)，因此該方法不能直接用于茶葉的生物堿含量 檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，而提供一種使用GC-MS法測(cè)定茶葉中 煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的方法。利用本發(fā)明提供的測(cè)定方法，能 快速、高效、環(huán)保地檢測(cè)茶葉中煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的含量。
[0006] 本發(fā)明正是在上述綜合文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，建立了茶葉中煙堿及次要生物堿的檢 測(cè)方法，并應(yīng)用建立的方法檢測(cè)了茶葉中煙堿及次要生物堿含量，發(fā)現(xiàn)茶葉中不僅有煙堿 的檢出，同時(shí)也有其他次要生物堿的檢出。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種使用GC-MS法測(cè)定茶葉中生物堿的方法，包括煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新 煙堿和可替寧的測(cè)定，具體包括以下步驟： 1)萃取溶液的配制:配制濃度為0.01%三乙胺的甲基叔丁基醚溶液為萃取溶液，具體配 制方法為：準(zhǔn)確移取50ul的三乙胺溶液到500mL的容量瓶中，加入甲基叔丁基醚定容至刻 度，配置成濃度為0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液。
[0008] 2)樣品的處理:稱取2 g茶葉末放入50 mL離心管中，然后加入1.0~6.OmLIO%的氫 氧化鈉溶液，靜置10 min，取10 mL步驟1)所配的萃取溶液到離心管中，并加入200 yL的 內(nèi)標(biāo)溶液，于旋禍混合器上以2000 rpm速度振蕩1 min;取1.0 mL上清液于內(nèi)含150 mg無水 硫酸鎂，50 mg PSA吸附劑，50 mg C18E吸附劑的2 mL凈化離心管中，于旋禍混合器上以 2000 rpm振蕩2 min，以5000 rpm離心3 min，取上清液過0.22 μπι有機(jī)相濾膜后，進(jìn)GC-MS檢 測(cè)； 所述內(nèi)標(biāo)為2-甲基喹啉，內(nèi)標(biāo)溶液濃度為800 yg/mL，用萃取溶液配制。
[0009] 3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備： 用萃取溶液配制六個(gè)不同濃度的均含有200yL內(nèi)標(biāo)溶液的煙堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（因煙堿 會(huì)降解為降煙堿和麥斯明，所以要單獨(dú)配制），濃度范圍：1.144-57.2 yg/mL， 用萃取溶液配制六個(gè)不同濃度的均含有200yL內(nèi)標(biāo)溶液的降煙堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度 范圍：1.456-72.8yg/mL， 用萃取溶液配制六個(gè)不同濃度的均含有200yL內(nèi)標(biāo)溶液的麥思明、可替寧、假木賊堿、 和新煙堿的混合標(biāo)樣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各成分濃度范圍：麥思明：〇. 792-39.6yg/mL，可替寧： 1.264-63.2yg/mL,假木賊堿：1.376-68.8yg/mL,新煙堿:0.88-44yg/mL; 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的具體配制方法如下： ①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制： 煙堿儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取約15. Omg煙堿，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/甲基 叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀釋定容至刻度，該溶液在4°C~8°C條件下避光保存； 降煙堿儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取約15. Omg降煙堿，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀釋定容至刻度，該溶液在4°C~8°C條件下避光保存； 麥斯明儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取約10.Omg麥斯明，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀釋定容至刻度，該溶液在4°C~8°C條件下避光保存。 [0010]假木賊堿和新煙堿混標(biāo)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取約15. Omg假木賊堿、10.0 mg新煙堿置于 25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液（即萃取溶液)稀釋定容至刻度， 該溶液在4°C~8°C條件下避光保存； 可替寧儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取約15. Omg可替寧，置于25mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺/ 甲基叔丁基醚溶液(即萃取溶液)稀釋定容至刻度，該溶液在4°C~8°C條件下避光保存。 [0011]②系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 煙堿工作標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取20yL、50yL、100yL、250yL、500yL、lmL的煙堿儲(chǔ)備液于不 同的10mL棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確加入200yL內(nèi)標(biāo)溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液稀 釋定容至刻度，得到六個(gè)不同濃度的煙堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0012] 降煙堿工作標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取20yL、50yL、100yL、250yL、500yL、lmL的降煙堿儲(chǔ) 備液于不同的lOmL棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確加入200yL內(nèi)標(biāo)溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基 醚溶液稀釋定容至刻度，得到六個(gè)不同濃度的降煙堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0013] 麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿的混和標(biāo)樣工作標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取20μL、50μ L、lOOyL、250yL、500yL、lmL的麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿混標(biāo)儲(chǔ)備液于不同的10mL 棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確加入200yL內(nèi)標(biāo)溶液，用0.01%三乙胺/甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至 刻度，得到六個(gè)不同濃度的麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿的混和標(biāo)樣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0014] 4)氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定:利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品 處理液進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀條件如下： 色譜柱:恪融石英毛細(xì)管柱，30m X 0.25mm X 0.25μηι，固定相:35%-苯基-甲基聚娃氧 烷;載氣:氦氣，載氣流速：1. 〇 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250°C;進(jìn)樣量3yL，分流進(jìn)樣，分流比5: 1;采用程序升溫方式:初始溫度：l〇〇°C;初始時(shí)間：3min;以8°C/min速率由100°C升至260 °C，保持lOmin，總運(yùn)行時(shí)間：33min; 檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器;溶劑延遲:8min;電離電壓：70ev;離子源溫度：230°C ;傳輸線溫 度：280°C;掃描離子范圍：33~400amu;質(zhì)譜掃描方式:選擇離子監(jiān)測(cè)（SHO。各化合物定量 及定性離子參見表1。
[0015] 表1質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)生物堿的保留時(shí)間及定量定性離子
5)測(cè)定方法：以目標(biāo)物的色譜峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線;對(duì)制 備好的樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得檢出目標(biāo)物的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到樣品中的煙 堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的含量。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，優(yōu)化了儀器檢測(cè)條 件，本發(fā)明具有如下效果： (1) 檢測(cè)時(shí)間短:采用本發(fā)明測(cè)定茶葉中煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿、麥思 明和可替寧周期僅需要33分鐘左右； (2) 本發(fā)明具有操作準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0017]①本發(fā)明方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢獅艮： 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的標(biāo) 準(zhǔn)系列溶液，得到6種化合物和內(nèi)標(biāo)的積分峰面積，分別用6種化合物的積分面積與內(nèi)標(biāo)峰 面積的比值作為縱坐標(biāo)，各化合物的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值作為橫坐標(biāo)，分別建立6種化合物 的校正曲線。定量采用2-甲基喹啉作為內(nèi)標(biāo)。對(duì)校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，R 2應(yīng)不小于0.99。 測(cè)定樣品時(shí)，根據(jù)樣品中的峰面積計(jì)算萃取液中6種化合物的濃度(yg/mL)。
[0018] 表2茶葉中煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限
注:檢出限以3倍信噪比（S/N = 3)計(jì)算。
[0019] ②本發(fā)明方法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率： 表3方法的回收率與重復(fù)性（n=3)
對(duì)樣品進(jìn)行高、中、低不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)樣品分別測(cè)定3 次，計(jì)算本方法各種茶葉中煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿和可替寧的回收率及加 標(biāo)后測(cè)定值