一種預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì)p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞對(duì)特定藥物的敏感性測(cè)定方法，尤其涉及一種預(yù)測(cè)大腸癌細(xì) 胞對(duì)P38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，大腸癌在我國(guó)的發(fā)病率呈增高趨 勢(shì)，由于大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，故缺乏有效的防治靶點(diǎn)及手段。尤其是中晚期大 腸癌，其治療手段只能以化療為主，療效以及患者預(yù)后均較差。靶向治療是在細(xì)胞分子水平 上，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)（腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白分子或基因片段)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物， 藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特異地結(jié)合致癌位點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不波及正常組織細(xì)胞，代 表了腫瘤治療的新方向。
[0003] p38MAPK(p38絲裂原活化蛋白激酶)磷酸化包括轉(zhuǎn)錄因子和激酶在內(nèi)的大量底物 (MK2，HSP27等），在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞表面受體表達(dá)等方面發(fā)揮重要 作用，被作為腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)而廣為研究，部分P38MAPK激酶抑制劑(p38in)已進(jìn)入早 期臨床試驗(yàn)。臨床前研究表明：在大腸癌的治療中，p38in可提高部分大腸癌對(duì)5-氟尿嘧啶 的敏感性、降低伊立替康的耐藥。但是，也存在部分腫瘤對(duì)p38in耐藥。
[0004] 腫瘤的發(fā)生是多因素、多步驟的，加之細(xì)胞的異質(zhì)性、細(xì)胞信號(hào)通路的復(fù)雜性和高 概率的基因突變，現(xiàn)有技術(shù)并不能達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。因此，找到一種預(yù)測(cè)大腸癌對(duì) p38in敏感性的方法顯得尤為重要。目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道有方法可預(yù)測(cè)大腸癌對(duì)p38in的敏 感性。
[0005] PP2A是廣泛存在真核生物體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，是由催化亞基C亞基 (PP2AC)、結(jié)構(gòu)亞基A亞基(PP2AA)和調(diào)節(jié)亞基B亞基(PP2AB)組成的異三聚體。PP2AC物種間 具有高度的保守性，通過(guò)可逆磷酸化使已磷酸化激活的蛋白質(zhì)脫磷酸化，參與體內(nèi)眾多生 物學(xué)事件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的一種預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì)P38MAPK激酶 抑制劑敏感性的方法，有效地填補(bǔ)了預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì)p38in的敏感性手段的技術(shù)空白。
[0007] 申請(qǐng)人通過(guò)大量的研究和實(shí)驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，PP2AC通過(guò)參與調(diào)控P38/ERK/TSC2/ mTOR信號(hào)通路活性，決定大腸癌對(duì)p38in的敏感性;PP2AC低表達(dá)的大腸癌細(xì)胞對(duì)p38in敏 感，PP2AC高表達(dá)的大腸癌細(xì)胞對(duì)p38in耐藥。應(yīng)用免疫組化聯(lián)合免疫熒光技術(shù)（IHC/IF)或 者單獨(dú)地檢測(cè)大腸癌組織的PP2AC表達(dá)水平，可預(yù)測(cè)大腸癌對(duì)p38in敏感或耐藥。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0009] -種預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì)p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法，包括應(yīng)用免疫組化或 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)大腸癌細(xì)胞的PP2AC表達(dá)水平，并測(cè)算H-score的步驟;其中，若H-score 數(shù)值小于100，則判定大腸癌細(xì)胞對(duì)P38MAPK激酶抑制劑敏感，若H-score數(shù)值大于200，則判 定大腸癌細(xì)胞對(duì)P38MAPK激酶抑制劑耐藥。
[0010]為了優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0011]優(yōu)選地，免疫組化操作具體為：
[0012]步驟一，切片脫蠟至水：
[0013]二甲苯Ι、Π 脫蠟5-10min，充分脫去石蠟;梯度酒精脫二甲苯:水洗，然后將片子插 到抗原修復(fù)盒內(nèi)，用蒸餾水洗2遍；
[0014] 步驟二，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：
[0015] 將步驟一所得切片加入3%過(guò)氧化氫使液面覆蓋組織lOmin，用蒸餾水洗2次，每次 3min；
[0016] 步驟三，抗原修復(fù)：
[0017] 將步驟二所得切片置于檸檬酸緩沖液中微波加熱修復(fù)，待自然冷卻至室溫后先用 蒸餾水洗2次，再用PBS洗3次，每次5min;
[0018] 步驟四，用非免疫血清封閉，孵育：
[0019] 將步驟三所得切片用吸水紙將組織周圍的水分盡量吸盡，用免疫組化筆在組織周 圍畫一個(gè)圈，然后加入血清覆蓋組織，放入濕盒室溫孵育10-30min，濕盒底部加入少量的 水；
[0020] 步驟五，一抗孵育：
[0021] 棄去血清，滴加一抗4°C過(guò)夜孵育，第二天復(fù)溫45min后，用ros將切片洗3次，每次 5min；
[0022] 步驟六，二抗孵育：
[0023] 滴加二抗室溫孵育30min，PBS洗3次每次5min;
[0024] 步驟七，顯色反應(yīng)：
[0025] 加 DAB顯色5 - lOmin，浸入純水終止顯色；
[0026] 步驟八，復(fù)染：
[0027] 蘇木素染色，然后使用水沖洗，1 %鹽酸酒精分化組織顏色變紅立即取出放入水 中，水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，I、Π 二甲苯脫酒精各兩分鐘，晾干或吹干，滴加少量的中性 樹脂取一蓋玻片進(jìn)行封片；
[0028] 步驟九，H-score測(cè)算。
[0029]優(yōu)選地，免疫熒光操作具體為：
[0030]步驟一，包埋好的標(biāo)本用切片機(jī)切石蠟切片，經(jīng)60°C烘片2小時(shí)，二甲苯脫蠟，梯度 酒精復(fù)水；
[0031 ]步驟二，抗原修復(fù)，使用修復(fù)液，微波蒸汽2分鐘，98度水浴25分鐘，冷卻25分鐘； [0032] 步驟三，PBS洗3次，每次5min;
[0033] 步驟四，使用10%羊血清封閉60min;
[0034] 步驟五，一抗4°C孵育過(guò)夜；
[0035] 步驟六，二抗25°C孵育lh;
[0036] 步驟七，封片及檢測(cè)，滴加一滴內(nèi)含DAPI的封片劑封片；
[0037] 步驟八，H-score測(cè)算。
[0038] 本發(fā)明的方法還可以是聯(lián)合利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì) P38MAPK激酶抑制劑敏感性，即結(jié)合免疫組化和免疫熒光的H-score數(shù)值進(jìn)行判定。其中，H-score數(shù)值可以通過(guò)常規(guī)的算法確定，也可以通過(guò)Aperio Sc_an:Scope? Systems (Vista，CA, USA)測(cè)算。
[0039] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：申請(qǐng)人開創(chuàng)性地 發(fā)現(xiàn)了 一種準(zhǔn)確預(yù)測(cè)大腸癌細(xì)胞對(duì)P38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法，通過(guò)一般實(shí)驗(yàn)室均 具備的免疫組化或免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)大腸癌細(xì)胞的PP2AC表達(dá)水平并測(cè)算H-score，通過(guò) H-score數(shù)值，即可準(zhǔn)確地判定大腸癌細(xì)胞對(duì)p38MAPK激酶抑制劑敏感還是耐藥，預(yù)測(cè)方法 簡(jiǎn)單方便，填補(bǔ)了大腸癌細(xì)胞對(duì)P38MAPK激酶抑制劑敏感性預(yù)測(cè)手段的空白。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為實(shí)施例一中Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示的PP2AA、PP2AB及PP2AC在不同大 腸癌細(xì)胞系的表達(dá)量情況。
[0041 ]圖2為實(shí)施例二中SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示了不同PP2AC表達(dá)水平的大腸癌細(xì)胞增殖對(duì) p38in的敏感性不同。上圖為SB202190對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；下圖為L(zhǎng)Y2228820和 BIRB796對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
[0042]圖3為實(shí)施例三中平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示了不同PP2AC表達(dá)水平的大腸癌細(xì) 胞克隆形成能力對(duì)p38in的敏感性不同。左圖為SB202190對(duì)大腸癌細(xì)胞克隆形成的影響。柱 狀圖為平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量。
[0043]圖4為實(shí)施例四種軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示了不同PP2AC表達(dá)水平的大腸癌 細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力對(duì)p38in的敏感性不同。左圖為SB202190對(duì)大腸癌細(xì)胞軟瓊脂集 落形成能力的影響。柱狀圖為軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量。
[0044]圖5為實(shí)施例五中大腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤藥敏試驗(yàn)結(jié)果。顯示了不同PP2AC表達(dá)水 平的大腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤對(duì)p38in的敏感性不同。PP2AC低表達(dá)大腸癌對(duì)p38in敏感， PP2AC高表達(dá)大腸癌對(duì)p38in耐藥。
[0045]圖6為實(shí)施例六中免疫組化檢測(cè)結(jié)果。顯示了不同PP2AC表達(dá)水平的大腸癌細(xì)胞裸 鼠移植瘤組織P_S6、Ki67對(duì)p38in的敏感性不同。
[0046] 圖7為實(shí)施例七的Western blot檢測(cè)結(jié)果。顯示了p38in在大腸癌細(xì)胞移植瘤組織 的on-target effect JC:對(duì)照組；SB20: SB202190處理組。
[0047]圖8為實(shí)施例八的應(yīng)用免疫組化檢測(cè)組織芯片的結(jié)果。顯示了 PP2AC在人大腸癌的 表達(dá)量存在較大變異。左圖為不同PP2AC表達(dá)水平的大腸癌照片，棕色為PP2AC蛋白；右圖為 PP2AC表達(dá)水平定量(H-score)。
[0048]圖9為實(shí)施例九建立的40例PD)(模型病理檢測(cè)的結(jié)果(HE染色）。
[0049] 圖10為實(shí)施例十應(yīng)用免疫組化聯(lián)合免疫熒光技術(shù)(