一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種肺纖維化診斷標(biāo)志物篩查體系，具體涉及一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，屬于醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，肺纖維化的發(fā)病率和死亡率呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此，早期診斷和治療對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義。而肺纖維化在早期階段依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征及一些有創(chuàng)檢查，難以做到早期診斷并評(píng)價(jià)肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷程度，現(xiàn)無(wú)可靠的標(biāo)志物作為其早期診斷的指標(biāo)，單一標(biāo)志物無(wú)法評(píng)定其診斷、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸，因此，建立肺纖維化病例標(biāo)本數(shù)據(jù)庫(kù)和標(biāo)志物篩查體系，開(kāi)發(fā)一種高通量、多樣本、高特異性和敏感性的生物檢測(cè)技術(shù)，具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，為此，我們提出一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明具有高通量、多樣本、高特異性和敏感性的生物檢測(cè)技術(shù)，具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，可以有效解決【背景技術(shù)】中的問(wèn)題。
[0004]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0005]本發(fā)明提供一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述肺纖維化具體診斷方法:
[0006]1.病人數(shù)據(jù)庫(kù)及血液樣本庫(kù)的建立:
[0007]在多家醫(yī)院尤其是三級(jí)甲等醫(yī)院以及全國(guó)肺纖維化多中心研究醫(yī)院收集彌漫性間質(zhì)性肺疾病病人血液樣本，建立血液樣本庫(kù)，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行分類(lèi)管理。同時(shí)，收集所有研究對(duì)象詳細(xì)的一般人口特征、影像學(xué)和病理學(xué)資料，建立系統(tǒng)詳實(shí)的資料數(shù)據(jù)庫(kù)。為了驗(yàn)證肺纖維化患者生物標(biāo)志物的特異性和敏感性，我們將募集肺纖維化病人及正常健康人(吸煙和不吸煙者)、支氣管哮喘病人和coro病人，具體分組如下:
[0008](1)彌漫性間質(zhì)性肺疾病組(ILD組):募集100例彌漫性間質(zhì)性肺疾病病人，其中特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化組(IPF組)病人50例，風(fēng)濕系統(tǒng)疾病相關(guān)的肺纖維化(CTD組)病人30例，其他病人組(包括外源性過(guò)敏性肺泡炎、肺血管炎、及其他病理類(lèi)型的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎)20例。
[0009](2)正常對(duì)照組:健康吸煙組和健康不吸煙組各20例。
[0010](3)支氣管哮喘對(duì)照組病人20例。
[0011](4)C0PD對(duì)照組病人20例。
[0012]2.肺纖維化標(biāo)志物的篩查及其單克隆抗體的制備
[0013](1)肺纖維化標(biāo)志物的篩查及體系的建立
[0014]應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)4種不同細(xì)胞來(lái)源的主要生物標(biāo)志物SP-A、SP-D、KL-6、TGF-β、TNF-α、IL-8、IL-13、IL2 2、ET-1、MMP7、NAPSIΝΑ、CCL18、YKL40、CCN2、VEGF在肺纖維化病人及健康者、健康吸煙者、哮喘患者、慢阻肺病人的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并結(jié)合影像學(xué)和病理學(xué)特征，篩選出相對(duì)可靠和穩(wěn)定的敏感和特異性因子作為標(biāo)志物、并排除其他疾病可能出現(xiàn)的干擾因素。
[0015]應(yīng)用現(xiàn)有ELISA技術(shù)對(duì)所篩查的特異標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定，再根據(jù)肺纖維化的程度、病因進(jìn)行歸類(lèi)和分組。
[0016](2)生物標(biāo)志物單克隆抗體的制備:購(gòu)買(mǎi)所篩選出的肺纖維化生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)作為抗原，采用雜交瘤技術(shù)在小鼠體內(nèi)制備其單克隆抗體，并進(jìn)行純化，ELISA法檢測(cè)其抗體效價(jià)，對(duì)其抗原性、免疫原性、親和性進(jìn)行驗(yàn)證。
[0017]3.制備肺纖維化標(biāo)志物蛋白抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng):
[0018](1)芯片的選擇:選用載玻片作為片基，將載玻片硅烷化。
[0019](2)抗體芯片的制備:將上述生物標(biāo)志物的單克隆抗體通過(guò)點(diǎn)陣法在載玻片上進(jìn)行點(diǎn)樣，制備好的芯片放入濕盒中，4°C過(guò)夜。準(zhǔn)備用于下一步血清樣本的檢測(cè)。
[0020]4.抗體芯片檢測(cè)血清樣本:
[0021 ] (1)血清樣本的標(biāo)記:將血清樣本進(jìn)行生物素標(biāo)記，備用。
[0022](2)抗體芯片檢測(cè)血清樣本:將制備好的抗體芯片于室溫下封閉1小時(shí)，洗滌后將血清樣本加樣于芯片上，加熒光染料孵育后洗滌，用熒光芯片掃描儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。所得檢測(cè)數(shù)據(jù)采用分析軟件進(jìn)行分析與校正。
[0023]5.抗體芯片制備的條件優(yōu)化:
[0024]在整個(gè)芯片制備過(guò)程中，通過(guò)對(duì)點(diǎn)樣方式、點(diǎn)樣濃度、封閉劑的種類(lèi)、封閉時(shí)間、樣品生物素標(biāo)記試劑與血清蛋白的比例以及血清樣本最終檢測(cè)所用的分析濃度等條件一一進(jìn)行優(yōu)化。
[0025]6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
[0026]將肺纖維化生物標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并與傳統(tǒng)ELISA法測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，觀察其特異性和敏感性。
[0027]7.制定隨訪調(diào)查表:
[0028]對(duì)入組肺纖維化樣例進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤隨訪，每隔2個(gè)月檢測(cè)一次肺纖維化生物標(biāo)志物，觀察指標(biāo)的變化與疾病進(jìn)展、治療效果及預(yù)后的關(guān)系。
[0029]本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是:一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，由于采用了該檢測(cè)技術(shù):1.病人數(shù)據(jù)庫(kù)及血液樣本庫(kù)的建立;2.肺纖維化標(biāo)志物的篩查及其單克隆抗體的制備;3.制備肺纖維化標(biāo)志物蛋白抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng);4.抗體芯片檢測(cè)血清樣本;5.抗體芯片制備的條件優(yōu)化;6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;7.制定隨訪調(diào)查表，能夠做到早期診斷并評(píng)價(jià)肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷程度，避免病情惡化。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031]實(shí)施例:本發(fā)明一種肺纖維化早期診斷標(biāo)志物篩查體系及聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述肺纖維化具體診斷方法:
[0032]1.病人數(shù)據(jù)庫(kù)及血液樣本庫(kù)的建立:
[0033]在多家醫(yī)院尤其是三級(jí)甲等醫(yī)院以及全國(guó)肺纖維化多中心研究醫(yī)院收集彌漫性間質(zhì)性肺疾病病人血液樣本，建立血液樣本庫(kù)，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行分類(lèi)管理。同時(shí)，收集所有研究對(duì)象詳細(xì)的一般人口特征、影像學(xué)和病理學(xué)資料，建立系統(tǒng)詳實(shí)的資料數(shù)據(jù)庫(kù)。為了驗(yàn)證肺纖維化患者生物標(biāo)志物的特異性和敏感性，我們將募集肺纖維化病人及正常健康人(吸煙和不吸煙者)、支氣管哮喘病人和coro病人，具體分組如下:
[0034](1)彌漫性間質(zhì)性肺疾病組(ILD組):募集100例彌漫性間質(zhì)性肺疾病病人，其中特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化組(IPF組)病人50例，風(fēng)濕系統(tǒng)疾病相關(guān)的肺纖維化(CTD組)病人30例，其他病人組(包括外源性過(guò)敏性肺泡炎、肺血管炎、及其他病理類(lèi)型的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎)20例。
[0035](2)正常對(duì)照組:健康吸煙組和健康不吸煙組各20例。
[0036](3)支氣管哮喘對(duì)照組病人20例。
[0037](4)C0PD對(duì)照組病人20例。
[0038]2.肺纖維化標(biāo)志物的篩查及其單克隆抗體的制備
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