一種人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物col6a3的應(yīng)用方法及其檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種用作人結(jié)腸癌標(biāo)志物C0L6A3的 檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)腸癌在世界范圍內(nèi)是第三大男性腫瘤和第二大女性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 GL0B0CAN2012的統(tǒng)計，在2012年預(yù)計有74. 6萬男性和61. 4萬女性病人，整體致死率是 50. 1% (男性）和52. 1% (女性），表明預(yù)后生存很差。腫瘤發(fā)生不但影響個人家庭，也 帶來嚴(yán)重的社會影響、增加公共衛(wèi)生支出和財政負(fù)擔(dān)。因此，爭取早發(fā)現(xiàn)、早確證、早治療， 對于提高結(jié)腸癌的治愈率和延長預(yù)后生存時間具有非常重要的意義。結(jié)腸癌的初發(fā)階段 一般癥狀不明顯，容易被忽略，而一旦確證后則往往處于中晚期而使治療效果不佳，更影響 手術(shù)后的生存。所以，治療結(jié)腸癌或其他癌癥的一個關(guān)鍵在于盡可能早地發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌。一 般結(jié)腸癌的診斷，包括觀察排便習(xí)慣的改變、便血、腹痛等，直腸指癥，實驗室檢查包括血常 規(guī)、尿常規(guī)和大便常規(guī)、大便潛血試驗，影像檢查、B超、CT掃描、結(jié)腸鏡檢查等等。而血清 血液檢查則是最為通行、常規(guī)的檢查，常用標(biāo)志物為癌胚抗原（CEA)、結(jié)直腸癌抗原（CCA)、 CA19-9,但是這些抗原檢測的臨床效果差異比較大，且檢測的靈敏度和特異性有待提高。從 這個意義上說，發(fā)現(xiàn)新的同時具有高靈敏度、高特異性的血液標(biāo)志物是一件非常緊迫的任 務(wù)。利用這樣的新型標(biāo)志物，就可以在常規(guī)體檢篩查中盡早地發(fā)現(xiàn)早期結(jié)腸癌的存在。
[0003] 其次，對于手術(shù)后或放化療后病人的預(yù)后效果、生存情況的預(yù)測，常規(guī)方法有賴于 病理參數(shù)、?Μ分期、Dukes分期等方法，但在病理判斷上有時有人為因素干擾，非常需要有 差異顯著、靈敏度高、特異性好、操作方便的分子標(biāo)志物來作為輔助判斷手段，因此，尋找結(jié) 腸癌的有效標(biāo)志物，準(zhǔn)確判斷肺腺癌的臨床分期和預(yù)后成為廣大醫(yī)學(xué)研究者的迫切任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物C0L6A3的應(yīng)用方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物C0L6A3的檢測方法及其檢測 試劑盒。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的研究結(jié)果，定量PCR、酶聯(lián)免疫分析和組織免疫雜交證明，C0L6A3在 結(jié)腸癌組織中的表達量顯著高于在正常結(jié)腸組織的表達量。并且，C0L6A3的高表達將縮短 結(jié)腸癌患者手術(shù)后的生存期。因此，C0L6A3可以作為一種新的人結(jié)腸癌標(biāo)志物和篩選檢測、 治療抗結(jié)腸癌藥物的靶標(biāo)為有效判斷結(jié)腸癌癌變進程提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上完 成。
[0007] 本發(fā)明提供了人結(jié)腸癌標(biāo)志物C0L6A3的一種應(yīng)用方法，所述的應(yīng)用方法是 C0L6A3在制備診斷或預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、結(jié)腸癌臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后的制劑中的應(yīng)用。
[0008] 所述的標(biāo)志物C0L6A3在制備診斷或預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、結(jié)腸癌臨床分期、結(jié)腸癌患 者預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 所述的標(biāo)志物C0L6A3在制備診斷、緩解或治療結(jié)腸癌的藥劑中的應(yīng)用。
[0010] C0L6A3可以作為篩選制備診斷、緩解或治療結(jié)腸癌的藥劑的靶標(biāo)。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種人結(jié)腸癌標(biāo)志物C0L6A3的檢測方法，所述的方法包括步驟：
[0012] 分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；
[0013] 和/或
[0014] 檢測基因組DNA或者蛋白中C0L6A3的含量。
[0015] 所述的樣本為離體的人源的組織或者體液。
[0016] 利用C0L6A3的特異性引物擴增樣本中的基因組DNA，檢測C0L6A3的DNA含量。 [0017] 利用C0L6A3的抗體與樣本中的蛋白反應(yīng)，檢測C0L6A3的蛋白表達量。
[0018] 另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒，它包括特異性擴增C0L6A3的引物，或 者針對C0L6A3蛋白的抗體。
[0019] 所述的檢測試劑盒含有C0L6A3標(biāo)準(zhǔn)品。所述的C0L6A3標(biāo)準(zhǔn)品包括C0L6A3蛋白、 C0L6A3基因及其活性片段。
[0020] 本發(fā)明提供了一個用于區(qū)分人結(jié)腸癌組織以及癌旁正常結(jié)腸組織、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 結(jié)腸癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織的質(zhì)膜蛋白標(biāo)志物C0L6A3，以及利用該標(biāo)志物制備 判斷人結(jié)腸癌、結(jié)腸癌擴散，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后和預(yù)后的制劑 和試劑盒。本發(fā)明為有效判斷人結(jié)腸癌癌變進程提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的檢測試劑盒高效、 靈敏、特異性強，相關(guān)的檢測方法快速、簡便，成本較低。
【附圖說明】
[0021] 圖1定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定C0L6A3在結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞中高表達。A，C0L6A3蛋白 在3次定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，被鑒定到的序列覆蓋度占49. 3%~52. 3%。B，C0L6A3質(zhì) 譜鑒定的譜圖。左邊為iTRAQ標(biāo)簽譜圖，顯示肽段在成纖維細(xì)胞樣本中高，而在結(jié)腸癌上皮 細(xì)胞中低。右邊為C0L6A3特異肽段ALILVGLER的譜圖。
[0022] 圖2是分析C0L6A3蛋白在結(jié)腸（癌）成纖維細(xì)胞系和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達。圖 2-A是用Western blot方法分析C0L6A3蛋白在結(jié)腸（癌）成纖維細(xì)胞系和結(jié)腸癌細(xì)胞系 的表達水平。CCD-18C0是結(jié)腸成纖維細(xì)胞系，1031NF和0426NF是癌旁正常結(jié)腸成纖維細(xì) 胞系，1031CAF和0426CAF是結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞系，LoVo、HT29及SW620是結(jié)腸癌細(xì)胞系。 這是全細(xì)胞提取物的Western blot。FOGFaJimentin和a-SMA是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白， 這里用做對照。GAPDH是上樣內(nèi)參。圖2-B是C0L6A3蛋白在結(jié)腸（癌）成纖維細(xì)胞系和結(jié) 腸癌細(xì)胞系的培養(yǎng)上清中的表達水平。
[0023] 圖3是利用Oncomine公共數(shù)據(jù)庫中的基因表達芯片數(shù)據(jù)分析C0L6A3基因在結(jié) 直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達。圖3-A是利用Gaedcke Colorectal數(shù)據(jù)分析C0L6A3 在65對直腸和直腸癌組織中的表達的散點圖，散點下的數(shù)字表示病例或正常樣本的個數(shù)， P值為用Student t teSt(T檢驗）分析得到的顯著性值，星號代表該T檢驗用的是配對T 檢驗。圖3-B是利用Hong Colorectal數(shù)據(jù)分析C0L6A3在12例結(jié)腸和48例結(jié)腸癌組織 中的表達的散點圖。圖3-C是利用Kaiser Colon數(shù)據(jù)分析C0L6A3在5例結(jié)腸和100例結(jié) 腸癌組織中表達的散點圖。圖3-D是利用Ki Colon數(shù)據(jù)分析C0L6A3在41例結(jié)腸和82例 結(jié)腸癌組織中的表達的散點圖。圖3-E是利用Skrzypczak Colorectal 2數(shù)據(jù)分析C0L6A3 在20例結(jié)腸、20例結(jié)腸腺瘤或結(jié)腸癌組織中的表達的散點圖。圖3-F是利用Skrzypczak Colorectal數(shù)據(jù)分析C0L6A3在24例結(jié)腸和81例結(jié)腸癌組織中的表達的散點圖。圖3-G 是利用TCGA Colorectal數(shù)據(jù)分析C0L6A3在22例結(jié)直腸組織和215例結(jié)腸癌組織中的表 達的散點圖。
[0024] 圖4是利用商業(yè)化組織芯片進行C0L6A3免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果。圖4-A是展 示C0L6A3在基質(zhì)中陰性表達的正常結(jié)腸組織。圖3-B是C0L6A3基質(zhì)陽性表達的癌組織。 圖4-C和D是C0L6A3在基質(zhì)高表達的結(jié)腸癌組織。圖4-E，C0L6A3在癌旁和結(jié)腸癌基質(zhì)中 的表達。圖4-F，C0L6A3在癌和癌旁的上皮細(xì)胞中的表達。
[0025] 圖5是Kaplan-Meier曲線分析C0L6A3的基因和蛋白表達與結(jié)腸癌生存的關(guān)系 圖。圖5-A是C0L6A3基因表達與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖?；?表達數(shù)據(jù)來源于Oncomine基因表達公共數(shù)據(jù)庫的Smith Colorectal數(shù)據(jù)集。圖5-B是 C0L6A3基因表達與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖?；虮磉_數(shù)據(jù)來源 于Oncomine基因表達公共數(shù)據(jù)庫的Smith Colorectal 2數(shù)據(jù)集。圖5-C是C0L6A3蛋白在 結(jié)腸癌基質(zhì)中陽性表達和陰性表達與結(jié)腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖。 圖5-D是C0L6A3蛋白在結(jié)腸癌上皮細(xì)胞中陽性表達和陰性表達與結(jié)腸癌病人總體生存的 Kaplan-Meier曲線分析圖。圖5-E是C0L6A3蛋白各種表達組合與結(jié)腸癌病人總體生存的 Kaplan-Meier曲線分析圖。
[0026] 圖6是用ELISA的方法檢測結(jié)腸癌病人和正常人血漿中的C0L6A3蛋白表達。圖 6-A是ELISA分析結(jié)腸癌病人和正常人血漿中的C0L6A3蛋白表達，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的量測定 C0L6A3在病人和正常人血衆(zhòng)中的量，p值為用Student t test (T檢驗）分析得到的顯著性 值。η代表病例數(shù)。圖6-B是C0L6A3蛋白血漿表達的受試者操作特性（R0C)曲線分析。橫 坐標(biāo)代表假陽性或1-特異性，縱坐標(biāo)代表真陽性或靈敏度。對角線是參考線。AUC代表線 下面積。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明的人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Spondin-2可以用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩 查人結(jié)腸癌癌細(xì)胞擴散、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)腸癌臨床分期、結(jié)腸癌患者預(yù)后的制劑。人 結(jié)腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Spondin-2可以用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌的制劑；特 別是用于制備診斷、預(yù)測、檢測或篩查人結(jié)腸癌的試劑盒。下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明作 詳細(xì)說明，而不會限制本發(fā)明。
[0028] 實施例1
[0029] 用定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定、篩選到C0L6A3為結(jié)腸或結(jié)腸癌基質(zhì)成纖維細(xì)胞特異表 達的分泌蛋白。
[0030] 操作流程如下：
[0031 ] 1、結(jié)腸或結(jié)腸癌基質(zhì)成纖維細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞分泌蛋白收集、蛋白定量
[0032] 在100mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞3-4X106/皿，培養(yǎng)到70-80%滿。用無血清、無酚 紅DMEM/F12培養(yǎng)基洗細(xì)胞，繼續(xù)用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48小時。收集培養(yǎng)上清，離心，分別 收集細(xì)胞及上清。上清用0.45以111濾膜（1^11丨? 〇^公司）過濾，再用濾膜濃縮仏1^(3〇11 Ultra4mL，3kDa Filters(Millipore公司））。蛋白定量用常規(guī)BCA試劑盒（碧云天公司）。
[0033] 2、結(jié)腸或結(jié)腸癌基質(zhì)成纖維細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞分泌蛋白的iTRAQ標(biāo)記
[0034] 8重iTRAQ試劑（AB SCIEX公司）分別標(biāo)記結(jié)腸成纖維細(xì)胞(XD-18CO