一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗Sm抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗 Sm抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Sm是一位病人名字的縮寫，在這位診斷為紅斑狼瘡的病人血清中，首次找到了這 種抗體，因此命名。以后大量的報(bào)道證實(shí)在紅斑狼瘡病人血清中，存在此種抗體，屬于一類 抗核抗體。Sm系統(tǒng)中的主要蛋白質(zhì)抗原為8、8 /、04蛋白，分子量11~291^)，此外還有六、八\ B"、C、F、G以及68kD、150kD等蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與含鳥(niǎo)苷十分豐富的小核RNAs(snRNAs)即 UsnRNAs形成復(fù)合物。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)至少有13種UsnRNAs，即U1~U13snRNAS(3Sm抗 原由1]1、1]2、1]5、1]4/1]6與上述蛋白質(zhì)構(gòu)成小核核糖核蛋白〇]1、1]2、1]5、1]4/1]68111?^)，它在異 質(zhì)性核RNA(hn RNA)向成熟信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)化中起重要作用。
[0003] 抗Sm抗體I gG是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的特異性抗體，與抗dsDNA、抗核小體、抗核 糖體P蛋白抗體I gG-起可用于SLE的診斷?？筍m抗體可在5 %~40 %的SLE患者中檢出。系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(SLE)是一種發(fā)病率較高的慢性多系統(tǒng)疾病，伴有多種血清自身抗體，為典型的 自身免疫性疾病。但到目前為止其確切病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，這對(duì)SLE診斷、治療和預(yù) 防的進(jìn)展造成了很大障礙。患者血清中自身抗體檢測(cè)己成為SLE實(shí)驗(yàn)診斷的主要臨床指標(biāo)。 近年來(lái)，已在病人血清中檢出抗ΕΝΑ抗體、抗ds-DNA抗體、ANA和抗心磷脂抗體等多種自身抗 體。ΕΝΑ可分為3111、1?^、334、338、1^13和組蛋白等已知和未知成分共十幾種，其中3111、1?^和 Rib三者與SLE關(guān)系密切?？筍m抗體陽(yáng)性被認(rèn)為是SLE標(biāo)記性抗體，對(duì)SLE診斷意義很大目前， 使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析法在抗Sm抗體IgG免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用仍未見(jiàn)。
[0004] 中國(guó)專利CN103105489A公開(kāi)了檢測(cè)自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其 制備方法，涉及一種檢測(cè)多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無(wú) 用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品技術(shù)上的不足:在所述的硝酸纖維素膜 或尼龍膜上含有：分別由(^0ΝΑ、5ι?/ΚΝΡ、(ΧΡ、55Α，55Β，6Α0、ΚΑ、ΙΑ-2Α、Τ6，ΑΜΑ-Μ2,1(^Φ* 的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測(cè)線，1條高濃度質(zhì)控帶，1條中 濃度質(zhì)控帶及1條低濃度質(zhì)控帶。該專利公開(kāi)的是一種膜條免疫法，更能說(shuō)明膜條免疫法存 在的靈敏度較低、線性范圍窄、重復(fù)性差和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗Sm 抗體I gG的試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)抗Sm抗體I gG準(zhǔn)確和高精確 地定量測(cè)定。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗Sm抗 體IgG的試劑盒，所述試劑盒包括:Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品、Anti-Sm IgG試劑1號(hào)、Anti-Sm IgG 試劑2號(hào)、Anti-Sm IgG磁分離試劑、Anti-Sm IgG質(zhì)控品和清洗液。
[0007]所述Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品包括6個(gè)液體校準(zhǔn)瓶，所述液體校準(zhǔn)瓶?jī)?nèi)目標(biāo)濃度分別為 0、5、20、50、100、200RU/mL的抗Ant i-Sm抗體IgG和牛血清白蛋白的Tr is緩沖液；
[0008] 所述Anti-Sm IgG試劑1號(hào)為1個(gè)含有5mL的生物素標(biāo)記的Sm抗原和牛血清白蛋白 的Tris緩沖液的瓶；
[0009]所述Anti-Sm IgG試劑2號(hào)為1個(gè)含有15mL的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗體 和牛血清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0010] 所述Anti-Sm IgG磁分離試劑為1個(gè)含有5mL的鏈霉親和素標(biāo)記的磁微粒和牛血清 白蛋白的Tris緩沖液瓶;所述Anti-Sm IgG質(zhì)控品包括2個(gè)質(zhì)控瓶，所述質(zhì)控瓶?jī)?nèi)的濃度的 范圍分別為：16_24RU/mL 和80-120RU/mL。
[0011]所述試劑盒檢測(cè)原理為將待測(cè)樣品、所述Anti-Sm IgG試劑1號(hào)混合溫育，樣品中 的抗Sm抗體IgG與Sm抗原特異性結(jié)合，再加入所述Anti-Sm IgG磁分離試劑，抗Sm抗體IgG與 Sm抗原的免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面，洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，加入Anti-Sm IgG試劑2號(hào)并混合溫育。堿性磷酸酶標(biāo)記(ALP)的羊抗人IgG抗體與已經(jīng)結(jié)合在磁珠上的抗 Sm抗體IgG特異性結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后加入化學(xué)發(fā)光底物，ALP催化底物 發(fā)光，測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。在一定范圍內(nèi)RLU與樣品中抗Sm抗體IgG濃度呈正比，通過(guò) RLU就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)樣品的抗Sm抗體IgG含量。
[0012]本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是:一種抗Sm抗體IgG的磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試 劑盒的制備方法，所述試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0013] 步驟1.制備所述Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品包括:Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋液配制步驟和 Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品配制步驟：
[0014] 所述Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋液的配制步驟包括：
[0015] 加800mL純化水和11.2g的Tris到容器中，攪拌混合均勻，再加8.5g的氯化鈉和2mL 的Proclin300，攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，攪 拌至完全溶解，再將pH值調(diào)為7.0-7.5,用純化水定容至1L，使用0.2μπι濾器過(guò)濾，將獲得的 所述校準(zhǔn)品稀釋液保存在2_8°C待用；
[0016] 所述Anti-Sm IgG校準(zhǔn)品的配制步驟包括：
[0017] 用上述Ant i-Sm IgG校準(zhǔn)品稀釋液將抗Sm抗體IgG分別配制為0、5、20、50、100、 200RU/mL共6個(gè)濃度點(diǎn)；
[0018] 步驟2.制備所述Anti-Sm IgG試劑1號(hào)包括:Anti-Sm IgG試劑1號(hào)稀釋液配制步驟 和Anti-Sm IgG試劑1號(hào)配制步驟：
[0019] 所述Anti-Sm IgG試劑1號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0020] 加800mL純化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，攪拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，攪拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，攪拌至完全溶解，將pH值調(diào) 為7.0-7.5,用純化水定容至1L，使用0.2μπι濾器過(guò)濾，將獲得的所述試劑1號(hào)稀釋液保存在 2_8°C待用；
[0021] 所述Anti-Sm IgG試劑1號(hào)的配制步驟：
[0022]用0.2mol/L的pH9.0碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照Sm抗原與生 物素溶液質(zhì)量比為10:1的比例在Sm抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均 勻，室溫靜置18h，反應(yīng)生成Sm抗原-生物素連接物的反應(yīng)液，將得到的Sm抗原-生物素連接 物反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的生物素，得到Sm抗原-生物素連接物，再 用所述試劑1號(hào)稀釋液將Sm抗原-生物素連接物稀釋到0.1-0.3yg/mL，得到所述的試劑1號(hào)； [00 23] 步驟3.制備所述Anti-Sm IgG試劑2號(hào)包括:Anti-Sm IgG試劑2號(hào)稀釋液配制步驟 和Anti-Sm IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0024] 所述Anti-Sm IgG試劑2號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0025] 加800mL純化水、6.06g的4-羥乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，攪拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0. lg的ZnCl2、0.2mL的Proclin 300和0. lg的MgCh，攪拌至 完全溶解，將pH值調(diào)為7.5-8.0，用純化水定容至1L，使用0.2um濾器過(guò)濾，將獲得的所述試 劑2號(hào)稀釋液保存在2-8°C待用；
[0026] 所述Anti-Sm IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0027]將lmg的羊抗人抗體和2-4yL的10mg/mL的偶聯(lián)劑為2-亞胺四氫噻吩溶液，室溫靜 置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10yL，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后 抗體，將活化后的抗體保存在2_8°C備用，取1.5mg的堿性磷酸酶，加入5mg/mL的4-(N-馬來(lái) 酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液10-20yL，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱 除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，將活化后的堿性磷酸酶保存在2-8°C備用，再將上述活化的 羊抗人抗體與活化的堿性磷酸酶混合，在2_8°C條件下靜置12-24h，用Supperdex200凝膠純 化柱純化，獲得羊抗人抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，置于2-8°C保存?zhèn)溆?，將羊抗人?體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用所述試劑2號(hào)稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL，得到所述的試 劑2號(hào)；
[0028] 步驟4.制備所述Anti-Sm IgG磁分離試劑包括:Anti-Sm IgG磁分離試劑稀釋液配 制步驟和Anti-Sm IgG磁分離試劑配制步驟：
[0029] 所述Anti-Sm IgG磁分離試劑稀釋液配制步驟：
[0030] 加800mL純化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，攪拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為 7.9-8.1，用純化水定容至1L，使用0.2um濾器過(guò)濾，將獲得的所述磁分離試劑稀釋液保存在 2_8°C待用；