S1p1受體激動劑的評價方法和篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及評價鞘氨醇-1-磷酸1(以下稱為"S1P1"）受體激動劑的免疫抑制活性 和心臟毒性的方法，以及篩選具有強的免疫抑制活性且心臟毒性低的S1P1受體激動劑的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾多的自身免疫疾病的結(jié)果是，由于異常的免疫應(yīng)答，錯誤地識別自身的淋巴細 胞增殖并活化，全身性地攻擊自身或者攻擊自身特定的組織而呈現(xiàn)癥狀，但是其原因多種 多樣且并未明確。迄今為止，以抑制淋巴細胞的增殖、活化的藥劑為目標，各種免疫抑制劑 逐漸被開發(fā)且進入臨床應(yīng)用，但是由非特異性的細胞增殖抑制活性、細胞毒性作用引起的 副作用也不少，成為問題。
[0003] 近年來，作為針對復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥的藥劑而被認可的芬戈莫德（別名 FTY-720)由于不是通過使淋巴細胞因細胞死亡而枯竭，而是通過控制其定位來調(diào)節(jié)免疫， 因此作為具有新機制的藥劑而受到矚目。然而另一方面，對于芬戈莫德確認了包括心動過 緩、房室傳導阻滯(AV傳導阻滯)等心律不齊在內(nèi)的以心血管系統(tǒng)為中心的嚴重副作用，因 而成為問題。（非專利文獻1、非專利文獻2)。
[0004] 鞘氨醇-1-磷酸（以下稱為"S1P"）的受體是存在于細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)型受體 (GPCR)，被鑒定出有5種亞型受體(S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 ;別名為內(nèi)皮分化基因 EDG-1406-5 406-3406-6406-8)。已知在生物體內(nèi)磷酸化的芬戈莫德$了￥-?)與31?1受體、 S1P3受體、S1P4受體以及S1P5受體結(jié)合，作為激動劑發(fā)揮功能。
[0005] 已知淋巴細胞經(jīng)常消耗一定的時間在循環(huán)血液與淋巴組織中巡游，當從淋巴組織 移動至循環(huán)血液中時，淋巴細胞膜上的S1P1受體發(fā)揮極其重要的作用。以FTY-p為代表的 S1P1受體激動劑主要通過與淋巴細胞上的S1P1受體結(jié)合，將S1P1受體攝入細胞內(nèi)而使淋巴 細胞上的S1P1受體缺損。然后，由此將淋巴細胞隔離在二級淋巴組織而使循環(huán)淋巴細胞數(shù) 目下降。其結(jié)果是S1P1受體激動劑發(fā)揮優(yōu)異的免疫抑制活性(非專利文獻2)。另一方面，從 嚙齒類的研究來看，考慮是通過刺激S1P3受體來顯示心動過緩等心血管系統(tǒng)副作用(非專 利文獻3、4 )，因此，正在研究減弱了對S1P3受體的作用的S1P1受體激動劑。
[0006] 在這樣的狀況中，近年來報告了作為對S1P1受體和S1P5受體具有選擇性的激動劑 的BAF312(別名辛波莫德，Siponimod)的臨床試驗結(jié)果(非專利文獻5)，其中作為副作用的 心率降低作用和作為有效性的循環(huán)淋巴細胞數(shù)下降效果在相同用量下表現(xiàn)出來。因此，顯 示了僅僅通過分離對S1P3受體的作用不能在臨床上分離心臟毒性，由芬戈莫德表現(xiàn)的心臟 毒性作用的至少一部分是由對S1P1受體的激動劑刺激引起的毒性。
[0007] S1P1受體與抑制性Ga蛋白質(zhì)（以下稱為"Gai"）偶聯(lián)，在心臟中通過對受體的激動 劑刺激而活化的Gai與邰γ -起使G蛋白偶聯(lián)型內(nèi)向整流型鉀通道（以下稱為"GIRK通道"） 活化。由于在心臟中，GIRK1與GIRK4的復合體表達，因此考慮因為該激動劑刺激而產(chǎn)生A V傳 導阻滯、心率下降等心臟毒性(非專利文獻5、6)。
[0008] 關(guān)于作為對SIP受體的內(nèi)源性激動劑的SIP的激動劑活性，報告了雖然根據(jù)評價法 不同而會有一些不同，但是通常顯示約1〇ηΜ左右的50%活化濃度(EC50值）。另一方面，雖然 S1P的一般健常人的血中濃度以數(shù)百nM這樣EC50值的數(shù)十倍的高濃度存在，但是在一般健 常人中并不誘發(fā)心臟毒性。進而，存在下述矛盾：顯示同程度的EC50值的BAF312盡管與FTY-P同樣地有效血中濃度為數(shù)十nM這樣低的濃度，但是表現(xiàn)心臟毒性。
[0009] 這樣，S1P受體激動劑發(fā)揮作為其主作用的免疫抑制活性、作為其副作用的心臟毒 性的機制目前尚未充分地闡明。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻 1:W02013/094761
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1: Science，296，346-349(2002)
[0015] 非專利文獻2: Journal of the American Society of Nephrology，13(4)，1073-1083(2002)
[0016] 非專利文獻3 Journal of Biological Chemistry ,279( 14) ,13839-13848(2004)
[0017] 非專利文獻4:Molecular Pharmacology,58,449-454(2000)
[0018] 非專利文獻5:British Journal of Pharmacology,167,1035-1047(2012)
[0019] 非專利文獻6:Journal of Biological Chemistry,276(8) ,5505-5510(2001)
[0020] 非專利文獻7:Nature Chemical Biology，8,622-630(2012)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 發(fā)明所要解決的課題
[0022] 本發(fā)明是鑒于這樣的狀況而做出的，其目的在于，闡明SIP受體激動劑發(fā)揮主作用 和副作用的機制，基于該機制的信息，提供評價S1P受體激動劑的主作用和副作用的方法。 進而，本發(fā)明的目的在于，基于該機制的信息，提供篩選具有強的主作用且副作用少的S1P 受體激動劑的方法。
[0023]用于解決課題的方法
[0024] 存在眾多與S1P1受體的信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的分子，在這些分子中，即使著眼于與S1P1 受體偶聯(lián)的Ga蛋白，也存在眾多的亞型。在這樣的狀況下，本發(fā)明者為了解決上述課題而進 行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S1P1受體激動劑的免疫抑制活性與對表達S1P1受體與Gai2或Ga i3的組合的細胞的選擇性相關(guān)，S1P1受體激動劑的心臟毒性與對表達S1P1受體與Gail的組 合的細胞的選擇性相關(guān)。即，本發(fā)明者最終證明了，與S1P1受體偶聯(lián)的Gail、Gai2和Gai3,與 S1P受體激動劑的免疫抑制活性、心臟毒性相關(guān)。
[0025] 并且，基于該見解，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過檢測偶聯(lián)的Ga亞基(Gail、Gai2、Gai3)特異 性的激動劑活性，能夠評價S1P1受體激動劑的免疫抑制活性的強度、心臟毒性的高低，進而 能夠篩選免疫抑制活性強且心臟毒性低的S1P1受體激動劑，從而完成了本發(fā)明。
[0026] 因此，本發(fā)明涉及S1P1受體激動劑的評價方法和篩選方法，其特征在于，檢測偶聯(lián) 的Ga亞基特異性的對S1P1受體的激動劑活性，更詳細地說，提供以下（1)~(9)。
[0027] (1)評價S1P1受體激動劑的免疫抑制活性的強度的方法，
[0028] 該方法以S1P1受體激動劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體中 的至少一者的激動劑活性作為指標。
[0029] (2)評價S1P1受體激動劑的免疫抑制活性的強度的方法，
[0030] 該方法包括測定S1P1受體激動劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1 受體的激動劑活性的工序，
[0031] 在S1P1受體激動劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑 活性高于對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性的情況下，評價為S1P1受體激動劑能夠發(fā) 揮強的免疫抑制活性。
[0032] (3)評價S1P1受體激動劑的免疫抑制活性的強度的方法，
[0033] 該方法包括測定S1P1受體激動劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1 受體的激動劑活性的工序，
[0034] 在S1P1受體激動劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體中的至少 一者的激動劑活性高于內(nèi)源性激動劑S1P的情況下，評價為S1P1受體激動劑能夠發(fā)揮強的 免疫抑制活性。
[0035] (4)評價S1P1受體激動劑產(chǎn)生心臟毒性的容易程度的方法，
[0036]該方法以S1P1受體激動劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性作為指標。
[0037] (5)評價S1P1受體激動劑產(chǎn)生心臟毒性的容易程度的方法，
[0038]該方法包括測定S1P1受體激動劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性的工序， [0039]在S1P1受體激動劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性低于對與Gai2偶聯(lián)的 S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性的情況下，評價為S1P1受體激動劑不易產(chǎn) 生心臟毒性。
[0040] (6)評價S1P1受體激動劑產(chǎn)生心臟毒性的容易程度的方法，
[0041 ]該方法包括測定S1P1受體激動劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性的工序， [0042]在S1P1受體激動劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性低于內(nèi)源性激動劑S1P 的情況下，評價為S1P1受體激動劑不易產(chǎn)生心臟毒性。
[0043] (7) S1P1受體激動劑的篩選方法，
[0044] 該方法包括：
[0045]工序(a)，測定被測化合物對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體、與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與 Ga i 3偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性，以及
[0046] 工序(b)，選擇對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性 高于對與Ga i 1偶聯(lián)的S1P1受體的激動劑活性的化合物。
[0047] (8)根據(jù)(7)所述的方法，在工序(b)中，選擇對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai