一種基于金雜化炭黑插層還原石墨烯的甲胎蛋白電致化學發(fā)光傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于金雜化炭黑插層還原石墨烯的甲胎蛋白電致化學發(fā)光傳感器的制備方法。具體涉及一種金雜化炭黑插層還原石墨烯作為基底材料，利用納米多孔銀優(yōu)良的生物兼容性和大的比表面積來固載三聯(lián)吡啶釕和檢測抗體，制備了一種檢測甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一種很常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預后差。甲胎蛋白(α-fetoprotein，aFP或AFP)是唯一廣泛應用于診斷HCC的腫瘤標志物，是非侵入性診斷方法中的重要指標。甲胎蛋白主要來自胚胎的肝細胞，但當肝細胞發(fā)生癌變時，會產生大量甲胎蛋白，而且隨著病情惡化，甲胎蛋白在血清中的含量會急劇增加，因此對甲胎蛋白的早期診斷很重要。
[0003]目前已有的甲胎蛋白的臨床檢測方法很多，如酶聯(lián)免疫分析、放射免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等。但是上述方法具有放射性污染，靈敏度低，檢測周期長，步驟繁瑣等缺點。為了克服以上傳統(tǒng)分析方法的缺點，本發(fā)明設計了一種特異性強，靈敏度高，無放射性污染，操作快速簡便的電致化學發(fā)光免疫分析方法。
[0004]本發(fā)明將炭黑與石墨烯復合，得到了炭黑插層的還原石墨烯，解決了單獨使用石墨烯片層容易團聚的問題并提高了傳感平臺的導電性。金溶膠用于進一步功能化炭黑插層的還原石墨烯，提高了傳感器的電致化學發(fā)光性能。并采用去合金化的方法直接得到具有較大比表面積的納米多孔銀，用其固載三聯(lián)吡啶釕和二抗，在檢測甲胎蛋白抗原的過程中產生了逐步放大的電化學發(fā)光信號，有效地增強了電致化學發(fā)光免疫傳感器的靈敏度。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優(yōu)點，而且制備過程較為簡單，為目前有效檢測甲胎蛋白提供了新途徑。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是合成具有較大比表面積的炭黑插層還原石墨烯材料，其可固載大量的金溶膠，提高基底材料的導電性，增強傳感器的靈敏度。
[0006]本發(fā)明的目的之二是通過去合金化的方法得到表面具有負電荷的納米多孔銀，通過靜電作用牢固結合三聯(lián)吡啶釕，提高電致化學發(fā)光信號的穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明的目的之三是利用金雜化炭黑插層還原石墨烯作為基底材料，納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕為標記層，構建一種無酶、快速且超靈敏的夾心型電致化學發(fā)光免疫傳感器。
[0008]本發(fā)明的目的之四是將該夾心型電致化學發(fā)光免疫傳感器應用于甲胎蛋白的快速、靈敏檢測。
[0009]本發(fā)明的技術方案如下: 1.一種基于金雜化炭黑插層還原石墨烯的甲胎蛋白電致化學發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
(2)將2?10yL、濃度為1?3 mg/mL的甲胎蛋白抗體捕獲基底材料金雜化炭黑插層還原石墨烯溶液于電極表面，4 °C保存；
(3)用3?9yL、質量分數(shù)為0.5?1.5%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4 °C冰箱中孵化1?5 h，清洗干凈；
(4)將2?6yL濃度為0.0001?30 ng/mL的一系列不同濃度的甲胎蛋白用于捕獲抗體的特異性識別，室溫下孵化1 h，清洗干凈；
(5)將4?8此濃度為1?3mg/mL的納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記的甲胎蛋白抗體溶液滴在電極上與抗原特異性識別，室溫下孵化1 h，清洗干凈，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0010]2.甲胎蛋白抗體捕獲基底材料一金雜化炭黑插層還原石墨烯溶液的制備
(1)炭黑插層還原石墨稀溶液的制備
將25?75 mg氧化石墨稀加入到25?75 mL去離子水中，室溫下超聲2 h，得到溶液A;稱取2?300 mg炭黑分散在8?120 mL的N，N_二甲基甲酰胺中，室溫下超聲2 h，得到溶液B;將1?100 mL溶液A加入到1?100 mL溶液B中，室溫下超聲分散2 h，加入5?15 yL、體積分數(shù)為80 %的水合肼溶液，劇烈振蕩5 minaOO °C下加熱1?5 h，5000?8000 r/min下離心洗滌10?30 min，制得炭黑插層還原石墨稀復合材料；
(2)金雜化炭黑插層還原石墨烯溶液的制備
將1?3 mg炭黑插層還原石墨稀分散到1 mL超純水中，加入0.5?1.5 mL金溶膠，得到的混合溶液在室溫下振蕩12 ~ 36 h，5000 ~ 8000 r/min下離心洗滌10 ~ 30 min，制得金雜化炭黑插層還原石墨烯;將金雜化炭黑插層還原石墨烯重新分散于1 mL超純水中，得到基底材料金雜化炭黑插層還原石墨稀溶液；
(3)甲胎蛋白抗體捕獲基底材料一金雜化炭黑插層還原石墨烯溶液的制備
將1 mL、濃度為1?3 mg/mL的金雜化的炭黑插層還原石墨稀溶液與100?300 yL、濃度為5 ~ 15 yg/mL的甲胎蛋白捕獲抗體混合，振蕩12 h，4000 ~ 6000 r/min下離心洗滌10?20 min，得到甲胎蛋白抗體捕獲基底材料一金雜化炭黑插層還原石墨烯孵化物，將其分散于1?3 mL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，制得甲胎蛋白抗體捕獲基底材料一金雜化炭黑插層還原石墨烯溶液。
[0011]3.納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記的甲胎蛋白抗體溶液的制備
(1)納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記物溶液的制備
將0.1?10 mg銀招合金放入20?500 mL、濃度為0.5 ~ 1.5 mol/L的氫氧化鈉溶液中，室溫下化學腐蝕12?36 h，5000?8000 r/min下離心洗滌4?8次，在真空干燥箱里干燥24?48 h，制得納米多孔銀;將1?3 mg的納米多孔銀分散到1?10 mL超純水中，加入1?5 mL、濃度為0.5?1.5 mmol/L的三聯(lián)吡啶釕溶液，室溫避光振蕩12?36 h，4000?8000 r/min下離心洗滌3?9次，將產物重新分散到1 mL超純水中，得到納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記物溶液；
(2)納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記的甲胎蛋白抗體溶液的制備
將1 mL、濃度為1?3 mg/mL的納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記物溶液與100?500 yL、濃度為5?15 yg/mL甲胎蛋白檢測抗體混合，振蕩12?36 h，4000?6000 r/min下離心洗滌10?20 min，得到納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記的甲胎蛋白抗體孵化物，將其分散于1mL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，制得納米多孔銀-三聯(lián)吡啶釕標記的甲胎蛋白抗體溶液。
[0012]4.甲胎蛋白的檢測方法
(1)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，所制備的電化學發(fā)光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發(fā)光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為600 V，循環(huán)伏安掃描電位范圍為-1.8?-0.6 V，掃描速率為0.10 V/s；
(2)在10mL、pH 5.5?8.0的含100?150 mmol/L三乙醇胺的磷酸鹽緩沖溶液中，通過電化學發(fā)光系統(tǒng)，檢測對不同濃度的甲胎蛋白標準溶液產生的電化學發(fā)光信號強度，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替甲胎蛋白標準溶液進行檢測。
[0013]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明將炭黑與石墨烯復合，得到了炭黑插層的還原石墨烯，解決了單獨使用石墨烯片層容易團聚的問題，提高了傳感平臺的導電性。金溶膠用于進一步功能化炭黑插層的還原石墨烯，提高了傳感器的電致化學發(fā)光性能。
[0014](2)并采用去合金化的方法直接得到具有較大比表面積的納米多孔銀，用其固載三聯(lián)吡啶釕和二抗，在檢測甲胎蛋白抗原的過程中產生了逐步放大的電化學發(fā)光信號，有效地增強了電致化學發(fā)光免疫傳感器的靈敏度。
[0015](3)本發(fā)明將制備的夾心電致化學發(fā)光免疫傳感器用于甲胎蛋白的檢測，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、靈敏和特異性檢測。本發(fā)明對甲胎蛋白抗原檢測線性范圍為0.0001?30 ng/mL，檢測限達到33 fg/mL。
【具體實施方式】
[0016]實施例1一種基于金雜化炭黑插層還原石墨烯的甲胎蛋白電致化學發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
(2)將2yL、濃度為1 m