采用hplc同時測定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥、食品、保健品等行業(yè)領(lǐng)域，具體是一種同時測定具有生物活性的天然產(chǎn)物的HPLC方法，特別是涉及一種應用于HPLC中的波長轉(zhuǎn)換技術(shù)，用于同時檢測金銀花中綠原酸，木犀草素，木犀草苷3種抗氧化活性成分。
【背景技術(shù)】
[0002]金銀花是我國傳統(tǒng)中藥，為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或待初開的花。其味甘，性寒，具有清熱解毒、疏散風熱，疏利咽喉、消暑除煩的作用，可治療暑熱癥、瀉痢、流感、瘡癤腫毒、急慢性扁桃體炎、牙周炎等病。金銀花主要含有揮發(fā)油、有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜苷類等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代謝前體木犀草素為代表的黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理作用。
[0003]目前天然產(chǎn)物的檢測方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可見分光光度法、二階導數(shù)光譜法、系數(shù)倍率法薄層色譜掃描法(TLC法)、高效液相色譜法(HPLC法)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)、導數(shù)極譜法和HPLC法與其它方法的聯(lián)用。目前，隨著分析檢測技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測方法比如薄層色譜、分光光度法等逐漸地被精確的檢測方法所取代。高效液相色譜法、氣相色譜法等已經(jīng)成為主流的檢測方法。這些方法相對于傳統(tǒng)方法，能夠檢測到天然產(chǎn)物單體化合物的含量，得到的試驗數(shù)據(jù)更精確。
[0004]綠原酸和木犀草苷是藥材金銀花中的代表性藥效成分，中國藥典2000年版公布了用高效液相法測定金銀花中綠原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色譜法(HPLC法)來測定木犀草苷含量的標準方法，但由于綠原酸與木犀草苷分子結(jié)構(gòu)差異較大，要采用不同的HPLC分析方法對兩種物質(zhì)含量進行分別測定，需要用到兩種不同的色譜柱及檢測條件，工作量大，測定時間長，不利于快速分析和大批量樣品質(zhì)量控制的需要。
[0005]中國發(fā)明專利201110031466.4提出一種HPLC波長切換同時測定白芍及炮制品中9種成分含量方法，該方法利用同一種檢測條件和波長切換的方法，既可以達到增加質(zhì)量覆蓋面的目的，又可以保證每種成分在最大吸收波長處被檢測，提高檢測靈敏度。中國發(fā)明專利201210079072.0提出一種HPLC波長切換技術(shù)同時測定牡丹皮、大黃牡丹皮藥對及含大黃牡丹皮藥對的制劑中多種成分含量的方法，該方法利用多不同時間段的不同梯度洗脫條件以及不同的檢測波長，可依次測定樣品中1-6種成分的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對目前對于金銀花中多種有效成分同時檢測方法的存在空白缺失，以及HPLC檢測方法在多種中藥材成分檢測中的應用現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種靈敏度和精確度高，工作流程簡便的采用HPLC同時測定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法。
[0007]本發(fā)明建立一種基于HPLC的檢測方法，首次提出基于HPLC轉(zhuǎn)換波長技術(shù)及梯度洗脫技術(shù)應用于同時檢測金銀花中的3種標志性有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本發(fā)明方法根據(jù)金銀花中3種有效成分分子性質(zhì)的差異，運用HPLC梯度洗脫技術(shù)控制其洗脫時間，以及根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)及波譜性質(zhì)差異，運用波長轉(zhuǎn)換技術(shù)，達到同時檢測的目的；采用梯度洗脫和檢測器波長轉(zhuǎn)換技術(shù)，通過調(diào)節(jié)色譜條件(流動相、柱溫、流速、波長等)，實現(xiàn)金銀花中綠原酸、木犀草素和木犀草苷3種抗氧化活性成分的同時定量檢測。
[0008]本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]采用HPLC同時測定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步驟:
[0010]1)測試樣溶液的配制:取干燥的金銀花或其植物葉莖0.5?2.0g，切細并攪碎后放置容器中，加質(zhì)量濃度為50?80%乙醇5?20ml，超聲處理，過0.45μπι的濾膜，添加乙醇定容，得測試樣溶液；
[0011]2)測定金銀花中3種有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的含量:取步驟1)的測試樣溶液，上0DS色譜柱，梯度洗脫:洗脫液為乙腈與磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的質(zhì)量濃度為0.1?1.0% ;流動相中乙腈的濃度梯度隨時刻的變化情況如下:
[00?2] (1)第一梯度，從起始時刻Omin至時刻ti，質(zhì)量百分比計，乙腈由初始的Caq上升到CAi;ti = 5?13min;CAo = 0.1 ?10% ;Cai=13?18% ；
[0013](2)第二梯度，從起始時刻乜至時刻t2，乙腈A由CA1上升到CA2 ； t2= 15?22min ； CA2 =20?26% ；
[0014](3)第三梯度，從時刻t2至時刻t3，乙腈A由Ca2上升到Ca3; t3 = 23?30min;CA3 = 28?35% ；
[0015](4)第四梯度，從t3至時刻t4，乙腈A由Ca3下降至Caq; t4=35?45min;
[0016]控制洗脫液流速為0.5?1.0mL/min，柱溫為20?40°C，檢測波長在初始時刻to至時刻丨5期間采用320?340nm，然后轉(zhuǎn)換波長為345?365nm進行檢測；t5 = 10?18min;依次測定，計算出金銀花中3種有效成分綠原酸、木犀草素和木犀草苷的含量。
[0017]優(yōu)選地，所述超聲處理的時間為10?50分鐘。
[0018]優(yōu)選地，所述超聲處理重復2次，合并2次超聲處理的提取液。
[0019]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果:
[0020]1)本發(fā)明首次提出基于HPLC轉(zhuǎn)換波長技術(shù)及梯度洗脫技術(shù)，應用于同時檢測金銀花中的3種標志性有效成分綠原酸、木犀草素、木犀草苷的方法，該方法與傳統(tǒng)檢測手段相比具有簡單、準確、快速、精密度高、重復性好的特點，對金銀花藥材及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有較高的應用價值。
[0021]2)減少工作流程。與中國藥典(2010年版)中所錄方法相比，本發(fā)明方法運用波長轉(zhuǎn)換技術(shù)，能在同一色譜柱、同一色譜條件下上完成3種標志性有效成分的檢測，縮短了一半以上的檢測工作流程；
[0022]3)提高檢測的靈敏度和精確度。本發(fā)明方法采用梯度洗脫，洗脫過程中調(diào)整流動相乙腈與磷酸水的混合比例，使極性小的組分加快洗脫流出，使三個組分出峰時間分得較開，峰形好，大大提高了檢測的靈敏度和精確度。
[0023]4)增加金銀花樣品質(zhì)量覆蓋面。中國藥典(2010年版)把綠原酸與木犀草苷的含量作為金銀花的檢測指標，而實際上木犀草素作為木犀草苷的代謝前體或代謝產(chǎn)物，同樣存在在植物體內(nèi)，并且木犀草苷進入人體后經(jīng)代謝成木犀草素后發(fā)揮其生物活性。因此同時測定綠原酸、木犀草素、木犀草苷3種有效成分有利于增加金銀花樣品質(zhì)量的檢測指標，擴大其有效成分檢測的覆蓋面。
【具體實施方式】
[0024]為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的實施方式不限如此。
[0025]實施例1
[0026]采用HPLC同時測定金銀花及其植物中3種抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步驟:
[0027]1.測試樣溶液的配制:取干燥金銀花0.5g，精密稱定，切細并置具塞錐形瓶中，加入10m質(zhì)量濃度為60 %乙醇，超聲處理20min，倒出上清液，再加入10ml質(zhì)量濃度為60 %乙醇，重復超聲提取20min，合并提取液，過0.45μηι的濾膜，添加乙醇定容至50ml，得到金銀花測試樣溶液。
[0028]2.對照樣溶液的配制:分別精確稱取一定量的綠原酸、木犀草素、木犀草苷對照品，于三個燒杯中充分溶解，用乙醇制成分別含綠原酸20yg/mL、木犀草素15yg/mL、木犀草苷15yg/mL的對照樣溶液。
[0029]3.測定金銀花中3種有效成分綠原酸，木犀草素，木犀草苷的含量，采用高效液相色譜法，應用波長轉(zhuǎn)換及梯度洗脫技術(shù):取一份步驟1制備得到的測試樣溶液，上0DS色譜柱(150X4.6πιπι，2μπι)，梯度洗脫，以質(zhì)量百分比計，洗脫液為乙腈-0.2%磷酸水混合液；第一梯度洗脫，由初始Omin時刻乙腈3 % (0.2 %磷酸水占97 % )上升至9min時乙腈13 % (0.2 %磷酸水占87%);第二梯度洗脫間，由9min乙腈13%上升至18min時乙腈22% (0.2%磷酸水占78%)；第三梯度洗脫由18min時乙腈22 %上升至27min時乙腈占32 % (0.2 %磷酸水68 % )；第四梯度洗脫由27min時乙腈32 %下降至42min時乙腈占3 % (0.2 %磷酸水97 % )。洗脫液流速控制為0.5mL/min，柱溫為25°C，檢測波長初始為325nm，在12min后轉(zhuǎn)換為350nm;理論塔板數(shù)不低于3000。
[0030]4.對步驟2的三個對照品混合溶液分別搖勻，過0.45μπι的濾膜，分別精密吸取混合對照品溶液適量，在步驟3的色譜條件下分別進樣進行測定；以進樣量(X，yg)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。
[0031]5.將步驟3測得的測試結(jié)果與步驟4得到的標準曲線對比。
[0032]精密度考察
[0033]精密吸取測試樣溶液lOyL，連續(xù)進樣5次，測得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的1?0均小于3%。
[0034]穩(wěn)定性考察
[0035]取測試樣溶液，分別在12小時內(nèi)進樣10yL，測得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的1?0均小于3%。
[0036]重復性考察
[0037]取金銀花樣品5份，每份0.5?2.0g，精密稱定，按步驟1方法平行制備5份測試樣溶液，分別進樣10yL進行測定。結(jié)果測得綠原酸、木犀草素、木犀草苷峰面積的RSD均小于3%。
[0038]加樣回收率考察
[0039]取已知綠原